枯草芽孢杆菌液体深层培养过程研究

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　　摘      要：枯草芽孢杆菌是一种可产生抗逆内生孢子的杆状细菌，在自然界广泛存在。它可改善动物肠道菌群、提高消化酶活性，被越来越多地研制成饲用微生态制剂。枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，其可以用于生产淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、5’-核苷酸酶、碱性磷酸酶等。枯草芽孢杆菌的培养有固体培养和液体深层培养等方式，各具特点。目前生物发酵生产的主要方式是机械化程度较高的液体深层发酵培养。对枯草芽孢杆菌液态培养的过程进行了跟踪研究。
　　关  键  词：枯草芽孢杆菌;液体培养;OD;糖
　　中图分类号：Q815        文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）08-1699-04
　　Abstract： Bacillus subtilis is a kind of rod-shaped bacteria that can produce endospores resistant to natural diseases. It can improve the intestinal flora of animals and increase the activity of digestive enzymes. Bacillus subtilis is the most widely used enzyme producing microorganism， it can be used to produce amylase， protease， glucanase， 5 '-nucleotide enzyme， alkaline phosphatase， etc. The culture of bacillus subtilis can be divided into solid culture and submerged culture.At present， the main method of biological fermentation is submerged culture with high degree of mechanization. In this paper，the liquid culture of bacillus subtilis was studied.
　　Key words： Bacillus subtilis; Liquid culture; OD; Sugar
　　枯草芽孢桿菌，是一种可产生抗逆内生孢子的杆状细菌，在自然界广泛存在，可用于生产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶，用于改善动物肠道菌群、提高消化酶活性，对人畜无害，不污染环境[1]，在酶制剂工业、畜牧业饲料行业应用广泛。枯草芽孢杆菌可通过定殖在目标动物肠道中，通过生物夺氧、颉颃致病微生物、产生多种消化酶等形式改善动物健康状况[2]。因而枯草芽孢杆菌被越来越多地研制成饲用微生态制剂。
　　枯草芽孢杆菌能够在生长过程中产生有用代谢产物，且大部分直接分泌到培养基中，枯草芽孢杆菌主要用于工业酶、生物防治、微生物添加剂、微生物学及分子生物学、医药卫生、水产养殖等领域。据2017年的数据，在全球范围枯草芽孢杆菌在各应用领域的消费比例依次是工业酶27%、生物防治18%、微生物添加剂15%、微生物学及分子生物学11%、医药卫生13%、水产养殖12%、其他4%。以枯草芽孢杆菌为主要生产菌株生产的蛋白酶、 淀粉酶产品，在淀粉糖、酒精、酿造、有机酸、食品等行业中应用广泛，仅此两种酶制剂产品就已占到整个工业酶制剂市场的50%以上。
　　以玉米粉、麸糠、豆粕、豆渣等为原料底物的固体培养基[3]，能够获得较好的枯草芽孢杆菌产量。但固体培养劳动强度大，原料利用率较低，生产周期较长。同时，放大生产时固体底料的灭菌仍存在一定困难。
　　液体深层发酵时采用液体培养基，置于微生物发酵罐中，经灭菌、冷却后，接种、培养。其机械化程度相对较高、产品质量稳定可控、回收率较高[4]，是目前微生物发酵培养的主要方式。
　　本文在前人研究的基础上，对枯草芽孢杆菌液态深层培养的过程进行了跟踪研究。
　　1  实验部分
　　1.1  菌种及培养基
　　枯草芽孢杆菌为中粮生物科技股份有限公司研究中心保藏的菌种。
　　摇瓶培养基：w（酵母粉）0.5%、w（蛋白胨）1.0%、w（葡萄糖）0.5%、w（氯化钠）1.0%、自然pH。
　　液体发酵培养基：w（豆粕）1.8%、w（大米粉）2.5%、w（玉米粉）1%、w（麸皮）0.4%、w（酵母浸粉）1.0%、w（葡萄糖）0.5%、w（氯化钠）0.7%、w（磷酸氢二钾）0.15%、w（氯化钙）0.5‰、w（硫酸锰）0.2‰、w（高温淀粉酶）0.2‰、w（吐温）0.1‰，余下为水，pH控制在6.8～7.2。
　　培养基配制完成后，于95 ℃下液化20 min，经121 ℃灭菌30 min，冷却备用。摇瓶培养基的接种操作在无菌环境下进行，液体发酵培养基的接种过程注意采取措施，降低染菌风险。
　　1.2  装置与控制
　　摇瓶培养条件：枯草芽孢杆菌冻存管自然解冻，在无菌环境下接入已于121 ℃灭菌并冷却至室温的摇瓶培养基中，接种量0.2%。往复式摇瓶柜，温度30 ℃，转速110 r·min-1。培养周期15 h。
　　液体发酵培养条件：50 L发酵装置，装液量40%，充分混匀后实消灭菌，接种量体积分数3%。控制转速300 r·min-1，温度32～34 ℃，风量1.0 L·min-1，罐压0.06 MPa。培养周期24～27 h。
　　1.3  检测方法 　　OD值检测：液体发酵培养基含有较丰富的糖及氮源，物料起始时的颗粒较大，故使用758滤布或脱脂棉对样品进行过滤后，取滤液1 mL定容到100 mL容量瓶，摇匀后于722分光光度计测定600 nm下的OD值。
　　pH值检测：pH值的检测使用pH计离线跟踪检测。
　　糖的检测：斐林试剂法（GB/T 5009.7—2008）、液相色谱法（GB/T 20880—2018）。
　　仪器条件：色谱柱为Aminex HPX-87H， 300× 7.8 mm;流动相为 0.005 mol·L-1 H2SO4;温度为40℃：流速为0.6 mL·min-1;进样量为 10 μL;检测器为示差折光检测器;分析时间为 20 min。
　　益生菌检测：GB/T 26428—2010附录A规定的营养琼脂培养基，即蛋白胨10 g·L-1、牛肉膏3 g·L-1、氯化钠5 g·L-1、琼脂16 g·L-1，余下为蒸馏水。调整pH至7.2±0.1，沸水浴加热溶解，以便各成分混合均匀，并于121 ℃灭菌20～30 min。所不同的是，针对本实验涉及的菌种，在正常的营养琼脂平板上的菌落光滑，24 h边缘规则，呈水滴状凸起，菌落较典型且菌落直径较大，极易造成培养平板上的菌落重叠覆盖。根据细菌在不同固体培养基的生长速度不同，故而计数所用营养琼脂平板的琼脂粉使用量为25 g·L-1，使其菌落较之正常平板更小，但有利于计数。
　　中性蛋白酶：GB/T 23527—2009。
　　2  过程分析
　　2.1  活菌数、OD
　　接入液体发酵培养基后，开始数小时内枯草芽孢杆菌处于适应期[5]。进入对数期之后，菌体快速繁殖，培养基开始剧烈产热，并伴有大量泡沫，5～9 h后泡沫趋于平稳，期间通过流加泡敌和控制通风、转速等方式来控制泡沫水平。
　　泡沫是空气与液体培养基接触时，由于密度差导致气体从培养基中溢出至表面，最终形成界面液膜，其破裂的难易与液膜强度有关。
　　分析认为，培养前期的泡沫主要是由于原料中的淀粉吸水膨胀并被水解造成培养基体系的黏度短时间内大幅增加，空气传递受到影响而引起。当水解基本结束后培养基理化性质趋于稳定，泡沫则转而由菌体代谢产生的酶系蛋白质产生，相对平稳。
　　从益生菌的变化看，当OD（稀释100倍）值达到0.20以上时活菌数已达到109 CFU·mL-1，之后的OD值变化与活菌数之间趋势基本一致，但已无显著的线性关系。从培养过程看，在所使用的培养基和培养条件下，培养6 h后活菌数已达到109 CFU·mL-1，继续培养活菌数仅在同一数量级水平上小幅变化，8 h后活菌数基本趋于平衡，见图1。
　　出现这种各个阶段活菌数增殖速率不同的结果，一方面与微生物增殖自身的生长特性有关，不同的生长期其增殖速率不同，另一方面也与培养基体系中的碳源不是单一碳源有关。当培养体系中存在不止一种碳源时，在同一时间内总有一种碳基质是其首选利用的，不同的碳源对菌体增殖的速率影响也不相同。
　　2.2  pH、还原糖
　　随着培养的进行，菌体的增殖、代谢不断消耗培养基体系中的還原糖。渡过迟滞期之后，随着糖的消耗，培养基的pH随之下降。当葡糖糖消耗殆尽时（0.5 g·L-1），培养基体系的pH值达到最低点，此时活菌数也基本到达极大值。之后还原糖仍然被继续消耗，但菌体的对数增长期已基本结束，糖的消耗仅用于维持最基本需要，菌体开始大量合成各种代谢酶。同时由于营养条件的匮乏和代谢产物浓度的不断上升，培养体系越来越不利于菌体生长，其开始向芽孢态转变。见图2。
　　枯草芽孢杆菌属于化能易养型微生物，其能够从有机物氧化磷酸化过程中获得生长繁殖所需的能量和碳骨架。有研究表明[7]，麸皮、豆粕是枯草芽孢杆菌繁殖的良好碳源，而玉米粉和酵母膏是其良好的氮源。枯草芽孢杆菌的培养应给予较少的碳源和较丰富氮源的供应，即碳氮比应控制在1～1.5。
　　培养结束时还原糖大于0.5%，对比跟踪的糖谱情况可以看出，培养后期的还原糖以多糖为主。多糖的存在为芽孢的形成准备了必要的物质条件。见图3。
　　枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，其可以用于生产淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、5’-核苷酸酶、碱性磷酸酶等，其中淀粉酶和蛋白酶属于胞外酶。从糖的变化看，多糖的持续降低说明菌体在增殖时产生了淀粉酶，以利用培养基中的淀粉和多糖。而葡萄糖水平自7 h开始便维持在较低水平，意味着枯草芽孢杆菌同大多数细菌一样，在其快速增殖阶段优先以单糖作为主要碳源。
　　2.3  酶活
　　温度和pH对酶活的测定有较显著的影响，一般而言，某一种酶在其适宜的温度和pH范围内才能表现出活性，过高或过低均会影响活性，甚至造成酶的不可逆失活。
　　枯草芽孢杆菌合成蛋白酶的模式属于中期合成型[4]，即细胞生长一段时间后才开始产酶，而在细胞生长进入稳定期后，酶的合成也随即停止。
　　营养体阶段的枯草芽孢杆菌产生大量的淀粉酶，用以水解培养基中的淀粉原料，产生菌体维持生命所需的糖。而当活菌数达到极大时，菌体的生命代谢不再以增殖为主，而是代谢产生蛋白酶。随着培养的进行，相应的蛋白酶活力逐渐提高，最终在24 h达到极大值。见图4。
　　随着培养条件的持续恶化，营养体开始向芽孢体转变，芽孢一般不在对数生长期出现，而只有当营养条件恶化、菌体的生长停止才出现芽孢。此时，营养细胞经过细胞膜翻转形成芽孢隔膜，进而形成原生质体、芽孢原生质体，最后形成内生孢子及外壳。在此过程中母细胞广泛更新自身的组织蛋白[6]，生长期产生的酶系开始被分解转化，用于形成芽孢壳和外壁。
　　2.4  发酵控制条件的优化
　　以1.1提供的培养基配方为基础，以培养结束的益生菌总数作为评判依据，分别对发酵设备转速和培养温度控制，进行单因素试验跟踪，见表1。 　　跟踪结果表明，温度和转速对培养结果均有显著影响。其中条件4获得的培养液活菌数最高，达到4.0×109 CFU·mL-1;条件5获得的培养液活菌数最低，仅有5.0×108 CFU·mL-1。在通气量相同的情况下，搅拌转速的改变使得培养体系溶氧的改变，对比发现提高转速、增加体系溶氧更有利于枯草芽孢杆菌的生长。资料显示枯草芽孢杆菌在30～40 ℃的温度范围内均表现出活力，但试验跟踪结果表明，本实验采用的此株枯草芽孢杆菌菌种在培养温度达到39 ℃时，其繁殖能力能仅达到其峰值的17.5%，同时镜检可观察到芽孢破裂衰亡后的残体。
　　3  结束语
　　枯草芽孢杆菌，因在枯草汁液中繁殖而得名。单个细胞（0.7～0.8）×（2～3）μm，芽孢体（0.6～0.9）×（1.0～1.5）μm。其自身可合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可利用蛋白质、多种糖及淀粉[8-9]。
　　正常情况下，枯草芽孢杆菌等微生物与其寄存的动物宿主以营养互作的方式共生。枯草芽孢杆菌产生的酪蛋白酶、明胶酶等有助于动物消化道对蛋白质、果胶的消化利用。同时枯草芽孢杆菌发酵产生的乙酸等短链脂肪酸，可很好地补充动物的能量需求。
　　微生物发酵培养过程的泡沫产生是不可避免的。对于本文涉及的培养基体系，枯草芽孢杆菌在深层培养过程中，分别在周期2～3 h、6～9 h及16 h之后出现泡沫，相对应的分别是底料泡沫（培养基体系的糖和蛋白质引起）、代谢泡沫（对数期呼吸、繁殖引起）、代谢产物泡沫（代谢产物积累、发酵液黏度上升引起）。通过预加化学消泡剂、控制过程风量、温度、转速等能够降低泡沫对培养造成的不利影响[10]。
　　随着葡萄糖被消耗，体系pH在前9 h内降到最低点，同时菌体的快速增殖活动也基本结束，菌体进入稳定期，开始代谢产酶。此时，培养体系的泡沫由原来因培养基基质的性质变化引起泡沫转变为代谢产生的酶系产生泡沫。糖、pH变化与凝结芽孢杆菌的培养过程变化趋势一致[8]。
　　厌氧条件下，枯草芽孢杆菌在含葡萄糖的复杂培养基中生长和发酵都弱;通风则细胞大量增殖，并伴有2，3-丁二醇、羟基丁酮和少量酸产生。培养过程的温度和溶氧對培养结果有较显著的影响。随着培养的进行，pH回升至中性附近，生存环境恶化。为应对外界环境的变化，菌体开始诱导产生内源孢子，芽孢内的吡啶二羧酸钙含量大幅增加[11]，培养基体系酶活因母细胞的蛋白质更新而降低。
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