佳宝苦瓜杂交种纯度的SRAP鉴定

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　　摘 要：利用SRAP技术对佳宝苦瓜杂交种子进行纯度鉴定。试验结果表明，从153对SRAP引物中筛选出1对引物Me6-Em4，能同时扩增出F1代及其父母本的多态性条带，且PCR扩增产物具有高度的稳定性和重复性；利用该引物对48株佳宝苦瓜进行纯度鉴定，其种子纯度为97.9%，与其田间鉴定结果接近，表明利用SRAP分子标记可以快速、准确地鉴定佳宝苦瓜杂交种纯度。
　　关键词：苦瓜；佳宝；SRAP；纯度鉴定
　　中图分类号：S642.5 文献标识码：A 文章编号：1001-3547（2016）16-0034-03
　　苦瓜（Momordica charantia L.）属葫芦科（Cucurbitaceae）苦瓜属一年生攀缘草本植物，原产印度和中国南方地区，现主要分布于热带和亚热带地区。苦瓜因其具备清爽解暑、营养丰富等特点，是我国长江以南地区夏季的重要蔬菜，属于典型的药食同源瓜类蔬菜[1]。苦瓜具有明显的杂种优势，因此苦瓜商品化种植的品种多为F1代杂交种。在苦瓜杂交种人工制种过程中，因隔离不严等原因常混有母本自交系种子，一旦大面积推广，会给菜农带来不可估量的损失，因此要求苦瓜杂交种在上市销售前必须经过纯度鉴定。近年来，苦瓜新品种更新速度较快，为保障后期良种的销售和安全使用，对育成杂交新品种进行快速鉴定及品种保护具有重要意义。以往以形态指标鉴别为主要方法进行苦瓜杂交种的纯度鉴定具有很大的局限性，随着DNA 分子标记技术的广泛应用，使得从基因组水平上检测苦瓜杂交种纯度成为可能，已被越来越普遍地应用于许多蔬菜品种的鉴别及指纹图谱的构建[2～4]。
　　苦瓜品种的分子鉴别也有报道[5～7]。自1974 年Grodzicker 创立RFLP 技术以来[8]，RAPD、SCAR、SSR、ISSR 等DNA 分子标记在动、植物和微生物等学科中得到广泛应用，并取得令人瞩目的进展，其中的SRAP （Sequence related amplified polymorphism）
　　是一种新型的分子标记技术，具有操作简单、稳定、多态性高等独特的优点，适用于植物遗传图谱构建、基因克隆、遗传多样性检测等方面的研究[9]。
　　以杂交种佳宝苦瓜及其亲本为材料，采用SRAP 分子标记技术，通过前期引物筛选及反复验证建立佳宝苦瓜杂交种纯度鉴定技术体系，有效地获得了该杂交种的纯度鉴定结果，为其纯度鉴定和该品种产权保护提供了科学依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　佳宝苦瓜杂交种及亲本由福州市蔬菜科学研究所提供，其母本08311-4是由台湾碧秀苦瓜经过多代自交纯化而成的自交系，父本0853-2则是由广东青秀苦瓜经多代纯化而成的自交系。佳宝苦瓜植株生长势强，连续结瓜能力强，早熟，第一雌花节位10～12节，商品瓜棒状，瓜长30～35 cm，横径6～
　　7 cm，肉厚1.1 cm，瓜色绿，油亮有光泽，圆瘤与短纵瘤相间，单瓜质量500～600 g，抗病性强，丰产。
　　1.2 试验方法
　　①基因组DNA的提取方法 种子用55℃的温汤浸泡15 min，再放在28℃左右的恒温箱催芽，待胚根长至1 cm 左右时转入穴盘育苗，待幼苗长到2 片真叶时随机抽取佳宝苦瓜及其父母本各20株，剪取刚展开的健康嫩叶，用液氮研磨，采用CTAB法进行总DNA提取，获得的DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳进行浓度和纯度鉴定，并稀释到30 ng/μL左右，于-20℃冰箱保存备用。
　　②SRAP多态性引物设计与筛选 根据SRAP引物设计原理合成26条引物，随机组合成153对SRAP引物。使用全部153对SRAP引物进行PCR扩增，分析并筛选出现差异条带的引物。对筛选到的出现特异条带的SRAP引物重复进行多次验证，直至获得稳定重复差异条带的SRAP 引物。
　　③PCR扩增 SRAP-PCR反应体系总体积为20 μL：Taq DNA酶（5 U/μL）0.2 μL，10×PCR buffer
　　2 μL，dNTPs （10 mmol/L） 0.4 μL，DNA模板0.5 μL，10 μmol/L 的上下游引物各4 μL，加ddH2O补齐至20 μL。SRAP-PCR扩增反应程序为：95℃预变性
　　3 min；94℃ 1 min，35℃ 1 min，72℃ 1 min，循环5次；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，循环35次；72℃延伸10 min。将PCR 扩增产物放置于4℃冰箱保存或直接用1%琼脂糖凝胶电泳快速检测。
　　④田间形态鉴定 于2015年3～6月在福州市蔬菜科学研究所试验地进行，3月7日播种育苗，3月28日定植，随机抽取150株植株挂牌编号，5月下旬在果实成熟时对果形、果色、棱、瘤等性状进行调查，统计杂种纯度。
　　2 结果与分析
　　2.1 DNA提取结果分析
　　经1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，结果表明，亲本及佳宝F1代3种苦瓜DNA提取的含量均较高，且总DNA中多酚类化合物及多糖等杂质去除的较为干净，DNA完整性也好，纯度高，适于下一步SRAP多态性分析（图1）。
　　2.2 特征引物的筛选
　　按照SRAP引物原则设计引物，选用上海翰宇生物有限责任公司合成的SRAP的9个上游引物（Me1～Me9）和17个下游引物（Em1～Em17）组成153对引物组合对材料进行扩增，分析差异条带，筛选出现差异条带的引物。试验结果显示，仅有1对引物Me6（5'-TGAGTCCAAACCGGTAG-3'）-Em4（5'- GACTGCGTACGAATTTGA-3'）扩增的杂种谱与母本有差异。对筛选到出现差异的Me6-Em4引物进行多次重复验证（重复提取DNA，以其为模板进行5次SRAP重复试验），结果能同时扩增出F1代及其父母本的多态性条带，其扩增产物具有高度的稳定性和重复性（图2）。 　　2.3 杂种纯度的鉴定
　　随机挑选若干粒佳宝F1代种子，按上述方法培育幼苗。随机抽取48个单株编号提取DNA，选用Me6-Em4特征引物进行佳宝苦瓜SRAP的分子纯度鉴定。
　　检测结果显示（图3），Me6-Em4扩增出双亲的特异条带，可确定为杂交单株，只有1株单株未扩增出父本的特异条带，可能是母本自交而来，为假杂种。因此，分子标记鉴定结果表明，该48株单株有真杂种47株，杂交种的纯度为97.9%。
　　2.4 杂交种田间鉴定
　　盛果期选取同批次播种的48株标记单株进行田间鉴定，鉴定结果发现，选取的48株农艺性状均符合佳宝苦瓜的性状特征，可以判断为真杂种。因此，田间鉴定结果表明，这48株单株的纯度为100%。杂交纯度分子鉴定与生物学性状田间鉴定结果接近，表明本批次的纯度达到国家用种标准，显示了在制种过程中良好的田间管理水平。
　　3 结论与讨论
　　杂交种子的纯度鉴定是农作物种子质量检验的一项重要内容。由于SRAP标记具有丰富的多态性、操作简便、稳定等优点，已被应用于多种农作物的种子纯度鉴定。本试验筛选出1对共显性SRAP标记Me6-Em4，检测佳宝种子纯度为97.9%，与其田间农艺性状的鉴定结果100%接近，并且SRAP标记鉴定的结果更为客观、可信。用SRAP标记鉴定替代田间鉴定，能够克服田间种植鉴定周期长、易受环境影响等缺点。结果也表明，要完全通过分子手段鉴定苦瓜杂交种纯度的达到对新品种保护的目的，还需要设计足够多的引物，才有可能获得有效的多态性引物，从而建立苦瓜杂交种种子的分子水平质量监控系统。
　　参考文献
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　　[2] 赵秀娟，宋建文，胡开林.苦瓜种质遗传多样性的SRAP标记分析[J].植物遗传资源学报，2013，14（1）：78-84.
　　[3] 严慧玲，闫树成，杨慧民，等.利用SRAP分子标记技术鉴定大白菜种子纯度[J].热带农业科学，2011，31（6）：50-52.
　　[4] 李丽，郑晓鹰，柳李旺.用SRAP标记分析黄瓜品种遗传多样性及鉴定品种[J].分子植物育种，2006，4（5）：702-708.
　　[5] 张少平，张玉灿，张伟光，等.RAPD及SRAP两种分子标记技术对苦瓜杂交种纯度的鉴定分析[J].生物技术进展，2014（4）：286-291.
　　[6] 林珲，李永平，朱海生，等.应用RAPD标记鉴定苦瓜杂种纯度[J].福建农业学报，2011，26（6）：977-980.
　　[7] 许端祥，高山，林碧英，等.佳美苦瓜纯度的SRAP鉴定[J]. 长江蔬菜，2011（18）：16-17.
　　[8] Guo D L， Zhang J P， Xue Y M， et al. Isolation and characterization of 10 SSR markers of Momordica charantia （Cucurbitaceae）[J]. American Journal of Botany， 2012， 99（5）： 182-183.
　　[9] 海燕，何宁，康明辉，等.新型分子标记SRAP及其应用[J]. 河南农业科学，2006（9）：9-12.
　　Abstract： In this study， SRAP markers technique was used for identifying the purity of Jiabao bitter gourd hybrid seeds. The results showed that only a pair of primers （Me6-Em4） was screened out from 153 pairs of SRAP primers， which could amplify the characteristic polymorphic bands of F1 generation and its parents， and the PCR products possessed high
　　stability and repeatability. Using the pair of primers to detect the purity of 48 individuals of Jiabao bitter gourd， the results showed that the purity was 97.9% for hybrid seeds of Jiabao bitter gourd， which was very close to the field morphological test， indicating that SRAP markers could be used to identify the hybrid purity of Jiabao bitter gourd rapidly and
　　accurately.
　　Key words： Bitter gourd； Jiabao； SRAP； Purity identification
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