急性毒性评价试验和体外预测方法

来源:用户上传      作者: 程树军 焦红

　　急性毒性是化妆品安全性评价最基础的试验，通常包括经口和经皮途径，必要时对某些极端的暴露途径(如吸入)也应给予考虑。急性毒性的主要目的是观察化学物急性毒性效应、剂量－反应关系、靶器官病变及其可逆性等。自从1927年Trevan第一次引入了半数致死量(LD50)的概念以来，LD50成为急性毒性的主要指标，但是，从上世纪70年代开始，LD50试验受到科学界和动物福利主义者的广泛批评，此后，经典急性毒性试验方案经过了多次改进。2002年，经典的经口LD50试验被废除，取而代之以3项优化方法。之后，急性吸入毒性的试验方法也进行了修订，并于2009年被法规认可。
　　
　　一、急性毒性试验
　　
　　化妆品急性毒性是指经口或经皮肤途径一次接触或24小时内多次接触某一化学物质，或4小时内吸入暴露化学物所引起的不良效应。“一次”接触，在经口途径染毒时，是指瞬间给予实验动物染毒，在经呼吸道与皮肤染毒时，是指在一个规定的时间段内使实验动物持续接触化学物的过程。而“多次”接触是指当外源化学物毒性很低时，即使一次给予实验动物最大染毒剂量仍不能观察到毒性作用，从而需要在24小时内对实验动物进行多次染毒，以达到规定的限制剂量。急性毒性试验可以分为两类。一类是以死亡为毒性终点的经典试验，主要是求得LD50。另一类实验不以死亡为观察终点，这类试验可得到受试物靶器官毒性和非致死性不良反应的数据。传统的急性毒性试验属于第一类。1984年，英国毒理学会首先提出不应使用大量动物来获得看似精确的LD50值，1987年经典LD50试验法最先被欧洲委员会废除，2002年，被OECD指南废除。
　　对于“急性吸入毒性试验”，经典的动物试验于2009年得到了修订，增加了3R的内容和非LD50的程序。2008年，OECD认可了德国提出的“急性吸入毒性一急性毒性分类(ATC)方法”，其原理类似于经口毒性试验的ATC法。2009年，重复剂量吸入毒性(28天或14天试验)和亚慢性吸入物毒性(90天试验)也按照3R的原则进行了更新。急性皮肤毒性仍沿用动物试验，它是指受试物应用于实验动物不超过体表皮肤面积的10％，经过14天观察，病理学检查毒性变化主测定LD50值，急性皮肤毒性试验对于皮肤吸收和其它亚慢性皮肤毒性试验的剂量确定是有用的。
　　化妆品急性毒性试验一般选用成年健康哺乳动物，首选大鼠，其次是小鼠，特别必要时才选择非啮齿类动物(犬或猴)。试验前首先要了解受试物的化学结构和理化性质，根据受试物的用途和有关测试规范设计实验方案。对于新化学物，还应检索与其化学结构和理化性质相似的化学物的毒性文献资料，这样既能提高动物实验结果的有效性和准确性，对于减少和优化实验动物的使用也是必需的。急性毒性的内涵是很丰富的，不能简单地理解为只是LD50的测定。试验结果的观察记录内容主要包括4个方面，即临床症状及发生过程、死亡情况和时间分布、体重和病理形态变化。观察时间一般要求14天。
　　
　　二、急性毒性试验的替代方法
　　
　　从法规的角度讲，化妆品急性毒性试验的主要目的是按照有关管理规定对其组份的固有毒性进行基本了解和分类，目的是保护公众健康。目前急性经口毒性试验的优化方法共有3项，即是固定剂量程序法(OECD TG 420)，急性毒性分类方法(OECD TG 423)和上下程序法(OECD TG 425)。每种方法均需预设剂量，开始剂量的确定可基于小范围内的预试验研究、细胞毒性筛选或已有资料进行分析。染毒后，观察动物明显的毒性症状，包括死亡(ATC或UDP)，或毒性症状(如FDP)。在欧美等国家以死亡为终点的试验已被所有法规废除，因此急性毒性试验中替代方法的使用已成为强制性的方法。三种替代方法中，ATC法最常用(在欧洲约50％的经口毒性试验采用此方法)。
　　
　　1　固定剂量法
　　于1984年由英国毒理学会(BTS)最早提出。该试验不以动物死亡为观察终点，而是利用预先选定的或固定的一系列剂量染毒，从观察化学物的毒性反应体征作为终点来对化学物的毒性进行分级。该方法的价值在于使估计化学品急性经口毒性所需要的动物量达到最小。试验各组选用同一性别(通常选用雌性)动物，以5、50、300和2000mg／kg四个固定剂量(特殊需要可考虑增加5000mg／kg)顺次进行经口染毒。根据预试验结果确定的能够产生毒性反应但又不至于引起死亡的剂量作为起始剂量。根据毒性反应和死亡的有无来确定是否在更高剂量或更低剂量继续进行试验。出现下列情况情况结束试验：1)当出现明显的毒性反应或已确认不多于一只动物死亡；2)最高剂量未出现毒性反应；3)最低剂量动物出现死亡。以初始剂量为50mg／kg为例，5只实验动物(包括预试验1只)，如果死亡数≥2只，则再选择一组动物给予5mg／kg的受试物；如果≥1只动物具有明显毒性，或1只死亡，则将该受试物按GHS分类为3类物质；如表现为无毒性，则再选择一组动物给予300mg／kg的受试物。FDP法估计LD50在一个限定的剂量间隔内，结果可按照GHS分级系统对化合物进行正确分类。
　　
　　2　急性毒性分类法
　　由Sumiey于1990年提出，该试验是以死亡为终点的分阶段试验法，试验分步进行，每一步使用单一性别(通常为雌性)的3只动物，确定动物的死活情况后再决定下一步试验。有3种可能的结局：(1)无需进一步试验即可分级；(2)同一剂量水平再做3只动物；(3)在高一级或低一级剂量水平另做3只动物。以开始剂量300mg／kg为例，给予3只动物染毒，如出现2～3只动物死亡，则下一步试验降低一级剂量，以50mg／kg剂量染毒；如出现0～1只动物死亡，则下一步试验再用同一剂量水平进行另外3只动物的染毒。与经典急性毒性试验法相比，采用ATC法仅需2～4步即可判定急性毒性分类，所用大鼠不超过12只，有效地减少了动物的使用量。
　　
　　3　上下增减剂量法
　　又称阶梯法，序贯法。由Dixon和Mood于1948年首次提出，1985年Bruce进行了改进。1987年该方法被美国材料学会(ASTM)采纳，2001年被OECD采纳。该方法最大的特点是大大减少实验动物的使用，不但可以进行毒性表现的观察，还可以估算LD50及其可信限，适合于能引起动物快速死亡的受试物。UDP由限度试验和主试验组成，限度试验分为2000mg／kg和5000mg／kg两个剂量水平，用于受试物毒性较小的情况。主试验是一个预先设计的染毒程序，每次染毒1只动物，由第1只动物染毒后的反应决定第2个动物

接受化学物的剂量，若动物存活，第2只动物给予高一级剂量，若第1只动物死亡或出现濒死状态，第2只动物给予低一级剂量。在对每只染毒动物仔细观察48h后，可以决定是否对下1只动物染毒以及确定染毒剂量。当满足停止试验的标准时可以结束试验。根据终止时所有动物的状态，用最大可能性法计算LD50值。采用上下增减剂量法确定LD50只需要6～9只动物。
　　
　　4　急性吸入毒性－急性毒性分类法
　　是将急性经口途径的分类法应用于吸入途径，原理与试验过程与经口的ATC相同，OECD列为TG436。该试验能满足大多数法规监管的需要，提供一个对LG50和GHS分类的范围估计。与传统的急性吸入毒性相比，替代方法使用了更少的动物。当然，新方法无法满足所有监管和科学研究的需要，必要时可执行修订后的动物试验(即TG403)。
　　
　　三、急性毒性的体外筛选方法
　　
　　早在上世纪50年代，利用体外细胞系统预测体内急性毒性效应的研究就开始了，人们发现体外细胞毒性与动物急性毒性死亡剂量之间具有相关高度性，还有研究表明诱发体外细胞毒性的化学物浓度与人血液该物质的致死浓度之间存在相关性。体外细胞毒性的用途，首先是代替LD50试验中的剂量确定试验用于预测急性经口毒性的开始剂量，其次作为系列组合试验的一部分，做为新化学物质分类和标识的依据，以减少或替代现行的动物实验，此外，还可用于毒性机制的研究中。
　　
　　1　预测体内毒性的开始剂量
　　最早由替代方法验证中心(ZEBET)提出了利用体外细胞毒性预测急性经口毒性试验的策略，在细胞毒性的IC50和急性经口毒性的LD50数据之间建立标准回归方程，用细胞毒性估计体内经口毒性的LD50的值，作为体内试验的开始剂量。目前经过验证的两项细胞试验方法分别BABL／c 3T3成纤维细胞中性红摄取试验和正常人角质细胞(NHK)中性红摄取试验。经过大量已有体内和体外毒理学数据的分析，目前公认的预测模型是公式：log(LD50)=0.435×log(IC50x)+0.625。
　　对于改良后的经口毒性试验，如果都能从细胞毒性试验资料获得最佳开始剂量的合理预测，则可以减少1～3个剂量的试验步骤。对于一个实验室，如何将细胞毒性试验数据用于ATC、UDP等动物实验方法开始剂量的计算呢?Spielman提出4步建议：第一步，从细胞毒性数据库中选择10－20种参考化学物质，用标准细胞毒性试验方法进行测试，最好用BABL／c 3T3中性红摄取法；第二步，用细胞实验中得到的IC50值与细胞毒性数据库中的LD50值进行线性回归分析，计算出本实验室的回归方程；第三步，将本实验室得到的回归方程与公认的回归方程比较，判断是否与之一致，并处于确定的预测区间内；第四步，如果符合上述条件，则可能用于体内毒性试验的预测，否则，建议改进细胞种类或试验方法以调整试验方法的敏感性。
　　
　　2　预测急性毒性的组合试验
　　细胞毒性试验可作为组合试验的一部分，用于急性毒性的预测。这几项细胞试验采用的是3种人类细胞系，由以下4个实验组合而成：
　　①HepG2细胞蛋白容量试验：肝细胞瘤细胞系Hep G2暴露于测试物中，通过Lowry法测定蛋白容量的改变，检测细胞毒性。作为序列试验的一部分，与②、③和④组合，或仅与试验②组合，可减少经口急性毒性的动物数量。
　　②HL-60细胞ATP含量试验：HL-60细胞(人类急性前髓细胞淋巴瘤细胞)暴露于测试物质中，采用(Lucifer-LU试剂盒)荧光素－荧光素酶反应产生的生物发光强度检测ATP含量(Kangas，1984)。作为序列试验的一部分，与①、③和④组合，或仅与试验①组合，可减少经口急性毒性的动物数量。
　　③张氏肝细胞形态学试验：该方法最早由Paul于1975提出。Chang肝细胞培养于石蜡封固的96-孔微孔板中，细胞形态变为纺缍状表明生长存在缺陷，以此作为生长抑制的判断依据。再培养7天收获培养物，可用于试验④。作为序列试验的一部分，与①、②和④组合，可减少经口急性毒性的动物数量。
　　④张氏细胞pH改变试验：试验③的培养物经168h后记录培养基(酚红指示剂的)pH颜色变化，正常为黄色，紫色可判断为完全受抑制，介于红色和黄色之间判断为部分受抑制。用于序列试验的一部分，与①、②和③组合，可减少经口急性毒性的动物数量。
　　
　　3、QSAR模型
　　有许多软件包用于预测人类健康的影响和相关的毒性，这些系统能够直接从化学物质的结构预测其毒性。由于其使用方便和快速的特点，已经在实践中得到应用，如TOPKAT系统。
　　
　　四、化妆品急性毒性预测的决策程序
　　
　　在目前急性毒性动物实验仍不可避免的情况下，建立科学合理的预测模型十分必要。目前已经开发出多种决策树(decision-tree)的方法，可避免大量急性毒性测试，通过最大化的利用现有的信息以预测其它化学物的可能效应。当现有信息的收集不能满足于危害评估所需资料的要求时，决策树的作用特别重要。由于化学物质的毒性效应主要受其化学结构的影响，因此，可按照大多数基于结构或广泛已知的理化特性的数据，将每种结构明确的化学物分类建立决策树分类系统。
　　决策树的毒性评估评估可覆盖与化学品危险性评估相关的全部毒性终点，运用的方法包括体外试验和计算机方法。对于急性毒性的决策树评估策略，特别应强调最高阈值浓度――阶层向下的方法(简称UTC)，体内试验只是最后的选择。具体决策步骤如下：
　　①是否有已知的人类或动物数据来显示该物质是急性毒素?(数据包括以往体内外急性毒性测试、流行病学研究结果、毒物单位数据、药物不良反应等)；如果数据质量与数量足以达到分类标识或风险评估的要求，则不要求做测试；若否，进入第2步。
　　②评估理化性质：理化性质数据有助于确定生物活性及在第7步PBPK研究中划分的，进入第3步；
　　③可否用计算机方法预测急性毒性?例如应用局部QSAR或适宜专家系统(如TOPKAT、MultiCASE、OASIS、ToxBoxes、DEREK)。如可成功应用一种以上的预测方法，则预测可被接纳与否?受试物急性毒性预测可应用于第7步的PBPK研究的，进入第4步。
　　④可否用计算机及体外方法预测可能的代谢产物及其毒性?代谢产物及其毒性预测可应用于第7步的PBPK研究的，进入第5步。
　　⑤进行一般细胞毒性试验(见前文)，测试结果可应用于第7步的PBPK研究的，以及要求确立体内研究初始剂量的，进入第6步。
　　⑥以体外细胞试验预测化学物的代谢能力。例如，肠吸收模型、血脑屏障模型。结果可应用于第7步PBPK研究的，进入第7步。
　　⑦进行PBPK及生物动力学模拟以预测主要靶器官毒性代谢作用、体内吸收。以PBPK模拟研究结果确定靶器官及第8步进一步体外试验的体内剂量浓度。
　　⑧进行体外靶器官毒性测试，例如，包括肝、肾、神经、心、肺细胞毒性试验。靶器官研究结果可用于证据权重评估的，进入第9步。
　　⑨将迄今为止所有数据进行证据权重评估。如证据足以显示物质是否具急性毒性，进行分类和标识或风险评估，不再要求做其它试验，否则进入第10步。
　　⑩进行优化的急性毒性试验，以中性红摄取法及其它相关研究预测初始剂量，再进行优化的动物试验(经口和吸入)或传统的动物实验(经皮肤)。
　　急性毒性实验的主要目的是为了预测化学物质对人体的作用，目前的研究结论认为基于人类细胞进行的检测与体内试验具有较好的相关性，因此，可以把体外细胞试验方法用于监管目的，以评价化合物的危害水平。首先需要正确了解急性暴露化学物质后引起的致死效应，其次才是对特定器官的损害。因此，科学可行的方法是采用分步骤的方案代替目前的急性经口毒性试验，即通过建立组合试验或阶梯试验预测化合物对人体的作用，具体包括简单的细胞毒性试验、生物动力学(代谢)试验和器官特异性实验。

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