不同核酸提取方法检测HIV病毒载量和耐药基因的研究

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　　[摘要] 目的 比较5种核酸提取法提取HIV RNA的效率。 方法 收集2015年HIV病毒感染者血样，使用不同核酸提取方法平行检测Ct值及载量值，分析检测的检出率、敏感性、变异系数、稳定性，并进行耐药扩增。 结果 5种提核酸方法检出率国产磁珠法最高，5种方法差异无统计学意义（χ2=7.98，P=0.09）；Ct值从小到大顺序为：国产磁珠法≥离心柱法>大批量法≥进口磁珠法>试剂盒自带法；重复性比较表明国产磁珠法检测结果较稳定；核酸胶显示国产磁珠法提取RNA浓度最高；提取方法不影响耐药关键位点检测。 结论 5种核酸提取方法均能检测HIV信息，国产磁珠法提取病毒核酸进行检测，敏感性和稳定性均较高。
　　[关键词] 核酸提取；荧光定量PCR；HIV载量；耐药基因；磁珠；HIV RNA
　　[中图分类号] R512.91 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）20-0111-04
　　[Abstract] Objective To compare the efficiency of HIV RNA extracted by five kinds of nucleic acid extraction methods. Methods Blood samples were collected from HIV infected persons in 2015. Used different methods of nucleic acid extraction to detect the Ct value and the load value. The detection rate， the sensitivity， the coefficient of variation， the stability， and the drug resistance were detected. Results Domestic magnetic bead method had the highest detection rate in five kinds of nucleic acid method， there was no statistically significant difference of 5 kinds of method （χ2=7.98， P=0.09）. Ct values from small to large order： domestic magnetic beads≥centrifugal column method>large quantities of extraction method≥imported magnetic beads>phenol/chloroform cracking. Repeatability tests showed that domestic magnetic beads was stable； Nucleic acid gel showed domestic magnetic beads to extract RNA concentration was highest； Extraction method did not affect the detection of drug resistance. Conclusion Five kinds of nucleic acid extraction methods are able to detect HIV information. The viral nucleic acid extraction using magnetic beads method， sensitivity and stability are higher.
　　[Key words] Nucleic acid extraction； Quantitative PCR； HIV load； Resistance gene； Magnetic beads； HIV RNA
　　人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）已在全球肆虐40余年。据WHO统计，至2015年底预计有1500万感染者接受抗病毒治疗[1]。根据《艾滋病治疗手册》，规定接受治疗的艾滋病患者必须定期检测病毒载量，用于反映药物疗效以及预防耐药的发生。抗病毒治疗可以降低艾滋病患者血液中的病毒载量，恢复部分免疫功能。但是长期接受抗病毒治疗、患者依从性差等均易导致对治疗药物产生耐药性，继而加剧耐药株的传播。非洲某些地区新发病者耐药性高达15.2%，诸多一线治疗药物失效[2，3]。
　　目前HIV病毒载量检测一般为RNA，克隆病毒基因片段关键在于高效提取RNA核酸。此外，对基因分型溯源分析、CD4+T细胞受体CCR5Δ32/Δ32、肿瘤循环DNA等研究也要求完整的序列片段[4-6]。核酸RNA模板提取的过程是影响后续试验结果的关键，尤其是对病毒水平较低的样本影响会更明显。基层疾控系统常用的病毒核酸提取方法主要有磁珠法和离心柱法[7，8]，多为进口试剂，进口试剂价格昂贵，近年来，国内基于实时荧光定量技术与不同的核酸提取方法进行研制，凯杰、达安基因、珠海丽珠与万泰生物等率先研发了国内病毒载量检测试剂，自带核酸提取试剂盒。本文选择了市售常见的5种RNA核酸提取方法，对HIV感染者血样进行HIV病毒载量和耐药基因检测比较，旨在评估国产试剂和进口试剂的灵敏性、重复性、核酸回收率，为基层疾病预防控制中心选择适宜的HIV病毒RNA核酸提取方法提供参考数据。现将结果报道如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　本次纳入检测为本地区共80例HIV感染者，其中男59例，女21例，平均年龄37.08岁，经酶联免疫、胶体硒法和蛋白免疫印迹确证。其中58例为2015年7月1日～12月31日新发现的病例，男45例，女13例，未经过治疗；22例为2015年之前发现的病例，经过治疗；全部患者均知情同意。 　　1.2试剂与仪器
　　国产磁珠试剂（NP968，西安天隆科技）；promage公司进口磁珠试剂（Maxwell 16）；离心柱法试剂（广州达安基因）；德国QIAGEN荧光定量载量检测试剂盒自带核酸提取法（careHIV-1 RT-PCR Kit），thermo scientific大批量提取仪器及试剂（96份磁珠处理仪）；德国QIAGEN荧光定量载量检测试剂盒（careHIV-1 RT-PCR Kit，Qiagen）。7500荧光定量检测仪为ABI公司产品。
　　1.3 方法
　　1.3.1 标本采集 使用EDTA抗凝离心管采血约3 mL，颠倒混匀取全血约500 μL保存备用，1500 rpm，4℃，离心5 min，取上层血浆、中间富含PBMC层约400 μL、余血清约500 μL分别保存于冻存管备用。非抗凝管采血800 μL，37 ℃水浴约30 min，取上层血清保存备用。上述样本全部于-80℃保存。
　　1.3.2 核酸提取 按试剂盒说明书进行，国产/进口磁珠法、大批量法提取原理为磁珠吸附核酸；离心柱法原理为煮沸裂解；试剂盒自带法原理为苯酚氯仿抽提。
　　1.3.3 不同核酸提取方法检测HIV病毒载量的方法 将80份血样分别采用5种核酸提取方法进行RNA提取后，于-40℃保存备用。将上述样品按试剂盒说明书进行HIV病毒载量检测，其中，反应液34.1 μL，酶0.5 μL，Enhancer 0.4 μL，提取RNA核酸模板15 μL，混匀后上机。感染者载量计算采用机读结果乘以提取后的核酸溶液体积和初始加的血样体积的比值。
　　1.3.4 5种核酸提取方法的稳定性检测方法 取上述阳性标本中的40份血样，梯度浓度为<103 IU/mL、103 IU/mL、104 IU/mL、105 IU/mL，每种梯度各10份样本。隔天重复3次分别采用5种核酸提取方法进行RNA提取后进行HIV病毒载量检测，计算10份样本Ct平均值，变异系数（CV）值。考察因素为5种方法组间比较，以及不同载量浓度样本间比较。
　　1.3.5 不同核酸提取方法对HIV病毒耐药基因检测结果的影响 在上述5种提核酸方法提取的RNA核酸中选取3份样本，梯度为102 IU/mL、103 IU/mL、105 IU/mL，且相互之间载量相差1 log，进行两轮巢氏PCR扩增pol基因区[6]，上下游扩增引物见董永慧等[9]报道；同时选取2个耐药血样，用5种方法提取RNA核酸。对所扩增的10份样本委托杭州擎科生物公司进行测序，产物长1316 bp。序列比较分析使用contig、BioEdit软件拼接并比对，序列拼接后将文本文档导入比较不同位点和提交斯坦福大学in-house网站，分析耐药突变[10，11]。将本实验室测得的12份耐药样本，耐受药物与某省疾控中心权威机构鉴定结果进行比较。测序引物序列见表1。
　　1.4 统计学分析
　　使用SPSS统计学软件16.0版本，检测阳性率使用行×列χ2检验，样本Ct平均值用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 5种核酸提取方法的HIV病毒载量检测结果
　　对80份样品用不同核酸提取方法提取的RNA核酸，检测阳性率国产磁珠法最高。5种方法差异无统计学意义（P=0.09）；国产磁珠法和离心柱法与试剂盒自带法检测阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=5.10，P=0.02；χ2=4.10，P=0.04）。见表2。
　　5种核酸提取方法均检测为阳性的60份标本中，国产磁珠法和离心柱法平均Ct值最小，其次为大批量法和进口磁珠法，试剂盒自带提取方法平均Ct值最大。表3中5种方法组间差异无统计学意义（F=2.026，P=0.167），两两比较显示国产磁珠法和离心柱法与试剂盒自带法差异有统计学意义（P=0.041、P=0.043）。
　　2.2 5种核酸提取方法的稳定性检测结果
　　所有提取方法的检测结果均较稳定，CV值均<5%，但其中国产磁珠法在5种提核酸方法中CV值最小，在0.77%～2.42%之间（表4）；103 IU/mL样本CV值>104 IU/mL和105 IU/mL。同一样本3次检测变化范围在0.08 log以内。
　　2.3 5种核酸提取方法对HIV病毒耐药基因检测结果
　　分别对5种方法提取的3个梯度的核酸样品，进行HIV病毒耐药基因检测结果，低载量样本仅使用国产磁珠法及离心柱法处理可扩增成功，但国产磁珠法扩增条带更明显。另外3种方法无扩增条带。高载量样本5种提取方法均能高效稳定扩增，测序结果5种提核酸方法所得序列片段略有不同，但不影响耐药关键位点检测（图1）。
　　3讨论
　　HIV核酸提取是载量和耐药基因检测的基础环节。目前病毒载量检测试剂主要有进口试剂和国产试剂。进口试剂提取核酸已经在疾病预防控制中心使用多年，该方法需要多步骤离心提取高质量、高纯度的核酸，依赖罗氏、梅里埃等检测仪[12]，设备试剂昂贵，操作技术专业要求高。而国产试剂主要采用磁珠法，利用变性剂破碎细胞，将游离出的核酸吸附在离心柱的硅胶模或者磁珠中的表面硅基结合，操作简单，且是全自动化平台，在成本方面也占有优势，易于推广。
　　从本次实验结果表明，国产磁珠法值与离心柱法相近，检出率最高[13]。国产磁珠法提取时间及人力投入优于离心柱法，但需要购置专用仪器。磁珠法水相洗涤，对病毒特异性核糖体RNA进行捕获扩增检测，有效排除杂质干扰，提高效率和纯度。试剂盒自带法得率不高或与病毒溶解度相关，提取物纯度和浓度对PCR反应体系产生影响[14]。在其他疾病包括病毒病、肿瘤等研究中与本研究核酸提取结果相似[15，16]，磁珠法在核酸提取中具优势，尤其是在痕量样品的提取中效果更为显著。 　　通过稳定性比较可知检测敏感性高的方法稳定[17，18]，从载量浓度上看，RNA浓度为104 IU/mL样本检测重复性最好。载量低的样本重复性最差，即载量低降解快。≥105 IU/mL样本对检测重复性有一定影响。相同样本，即使使用同种方法相近时间内检测，结果仍有0.08 log值的差异，所以建议观察载量控制效果应采用同一仪器同一方法比较。
　　核酸胶结果显示国产磁珠法提取RNA浓度高，提取的核酸能满足耐药基因测序要求，且不影响耐药关键位点检测，一般认为磁珠提取能降低抑制剂浓度、减少降解短核酸片段[19]。载量低的样本和进口磁珠法更易扩增出非目的片段。在实验中发现有高载量却扩增失败的样本，预计与其亚型有关[20]；本实验有载量检测不到却扩增成功的样本，原因为两轮PCR大大提高检测灵敏性。
　　综上所述，国产磁珠法与离心柱法的灵敏度、重复性、核酸回收率都较高，对于基层疾控中心及时检测病毒载量可代替进口试剂盒，用于HIV病毒载量及耐药基因检测。
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　　（收稿日期：2016-05-13）
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