湖南甜酒中乳酸菌的分离筛选及产酸性能优化
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【摘要】本实验通过革兰氏染色、过氧化氢酶试验和形态学检测从自制湖南甜酒中筛选分离出五株乳酸菌Lact.A-E，对其再进行稀释培养和平板划线纯化；最后通过产酸性能的筛选，得到了产酸能力最优菌株（Lact.A）、以及其最适pH（初始pH=6.5）和生长温度（35-40℃）。
【关键词】甜酒；乳酸菌；产酸能力；温度；pH
湖南甜酒属于糯米甜酒中的一种，香味清甜，口感绵醇，但因每个地区的环境、酿造甜酒所用材料及工艺的差异，而形成了每个地区独特的甜酒风味。乳酸菌在糯米甜酒发酵过程中是产酸和产生风味的关键，但目前对甜酒中酵母和霉菌的研究较多，对甜酒中乳酸菌的研究较少。乳酸菌是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性杆菌或球菌，不形成芽孢、不运动、厌氧或兼性厌氧，不能还原硝酸盐的一类细菌的总称[1]。甜酒发酵期间，优良的乳酸菌产生诸多益处，乳酸菌能赋予食品柔和的酸味和香气，改善食品的品质和营养，具有抗菌、降低胆固醇、维持微生态环境、抗肿瘤、抗变异原和增强免疫力等重要生物学功能，乳酸菌由于其所具有的独特生物功能特点，在食品中被广泛应用，现已成为当前研究开发的热点[2]。本实验旨在通过从湖南甜酒中分离筛选出产酸能力优良的乳酸菌，并探索其生长环境，应用于甜酒生产中。从而提高优势乳酸菌群的比例，使得产酸能力更佳，改善甜酒的风味。
1.材料与方法
1.1材料
自制湖南甜酒、牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾：、无水乙酸钠、葡萄糖、吐温80、 、 、 、琼脂、 、氢氧化钠、乙醇。
培养基：液体MRS培养基、固体MRS培养基（基于液体MRS培养基中加入1.8%琼脂）、乳酸菌分离培养基（含2% 的MRS固体培养基）、乳酸菌斜面保存培养基[3]（含葡萄糖2%的固体MRS培养基）。
1.2 主要实验设备
电子天平、光学显微镜、高压蒸汽灭菌锅、磁力加热搅拌器、电子万用磁炉、超净工作台、恒温培养箱、电热鼓风干燥箱、培养皿、KQ-250B型超声波清洗器、乳胶手套、载玻片、盖玻片。
1.3 方法
1.3.1甜酒样品选取
本实验选用发酵时间36h，甜酒情况良好，汁液浓稠，呈奶白色，口感甘甜芳醇的自制湖南甜酒，置于4℃冰箱冷藏保存。
1.3.2 乳酸菌的处理
1.3.2.1菌液的富集
采用一次性1mL注射器在超净工作台吸取1mL甜酒汁液，注射于液体MRS 培养基中（100mL），并放置于恒温培养箱（35℃）培养48h，进行菌液的富集。
1.3.2.2乳酸菌菌株的分离与纯化
以无菌操作吸取预富集菌液lmL于9mL无菌生理盐水中，呈1：10的稀释液，同法继续稀释成1：100及1：1000稀释液。取此三个稀释度的菌液各lmL分别注入三个无菌平皿内，将冷却至45℃左右的用于分离培养的含 的MRS固体培养基倾注入平皿，大约15mL摇匀，待凝固，倒置于35℃培养箱中培养48h。
对菌落进行革兰氏染色、镜检并做过氧化氢酶试验，重复以上操作至培养基上出现单一菌种，将纯化后的菌种编号并平板划线在相应培养基中培养48 h后，4℃保存备用[4]。
1.3.3产酸能力的筛选
将固体MRS培养基的pH统一调为6.4后，再将筛选的乳酸菌株分别接种于其中，置于35℃恒温培养箱内，静置培养，取36h时间段测菌液pH，根据不同菌种pH的变化确定产酸能力最优菌株。
1.3.4目的菌株产酸条件的优化
1.3.4.1温度的优化
在其他条件相同情况下，设定25℃、30℃、35℃、40℃、45℃的温度梯度并接种同等的量的菌种和100 mL经严格灭菌处理的MRS液体培养基（pH采取上一实验所测最适初始pH），每株菌每一温度条件下做6个重复，并在各温度下各做2个空白对照，置于恒温培养箱培养36h。
目测菌液浑浊度，采用4级记录符号（-、±、+、++）与pH变化相结合记录结果[4]。
1.3.4.2 pH的优化
在其他条件相同情况下，用1 mol/L的 溶液和1mol/L的 溶液调分别节液体MRS培养基的pH。将目的菌株分别接种于pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的100mLMRS液体培养基，每个梯度设置6个重复，以及2个空白对照，置于35℃恒温培养箱培养36h。
采用目测菌液浑浊度的方法，测定乳酸菌的群体生长量。采用4级记录符号（-、±、+、++）记录菌液浑浊度。根据目测结果以及pH的变化推断乳酸菌生长的最适pH与pH范围。
2.结果与分析
2.1碳酸钙形成的水解圈特征
因产酸量大的菌株可水解培养基中的碳酸钙形成水解圈，水解圈是判断菌株是否为乳酸菌的重要指标之一，其大小亦可作为标准判断菌株产酸的能力[5]。在含 的固体MRS上分离乳酸菌，经培养发现形成了明显的水解圈现象（图2.1）。经挑选得出水解圈大且明显的七株菌落，说明其产酸能力较强，并且初步鉴定为乳酸菌。
2.2 生理生化性质
2.2.1革兰氏染色
经初步分离得出的七株疑似菌株，经革兰氏染色后，Lact.A、Lact.B、Lact.C、Lact.D、Lact.E菌株均为革兰氏阳性（图2.2）。
2.2.2 过氧化氢酶试验 5株革兰氏阳性菌株经3%H2O2滴定，均无气泡产生，说明其均为过氧化氢酶阴性，符合乳酸菌的性质。
2.3 形态学的性质
经菌落形态特征观察发现，Lact.A、Lact.B、Lact.C、Lact.D、Lact.E的菌落形态均符合乳酸菌的特征（表2.1），从形态学角度判定5株菌均为乳酸菌。综上，可判断5株菌均为乳酸菌。
2.4 产酸能力
5株乳酸菌经产酸能力分析（表2.2），对每个梯度下36h后pH的平均值进行比较，发现Lact.A在36h后pH最低，δpH最大，说明在5株乳酸菌株里，Lact.A的产酸能力最优。
2.5 最适生长环境的选取
2.5.1 pH耐受的测定
目的菌株在其它条件一致，初始pH=6.5的条件下，最终pH最低（图2.3），菌夜浑浊度最高（表2.3）；说明在初始pH=6.5左右的条件下，目的菌株产酸能力最好，生长能力最佳。
2.5.2生长温度的测定
目的菌株在其它条件一致，初始温度为35℃或40℃的条件下，最终pH最低（图2.4），菌夜浑浊度最高（表2.4）；说明在35-40℃左右的条件下，目的菌株产酸能力最好，生长能力最佳。
3.结论
随着食品益生菌产业的发展，益生菌的鉴定及筛选成为了该产业一项的重要研究项目，乳酸菌作为应用价值极高的益生菌之一，也得到了广泛的研究。
本实验从湖南特产甜酒中进行乳酸菌的分离鉴定，获得了7株乳酸菌，经过经革兰氏染色、镜检后，确定其中5株为乳酸菌菌株，说明湖南自制甜酒中乳酸菌种类较为丰富。对5株乳酸菌并对其性能进行初步探索后，得到了一株优良菌种及最适pH和生长温度，可为湖南甜酒的大规模生产和保存工作提供一部分参考意见。
实验可进行进一步的最适生长环境探测，如最适碳源、氮源等。
【参考文献】
[1]卞立红，汪洋，张奕婷，曲丽娜.不同原味酸奶中乳酸菌的计数及产酸能力比较[J].广东农业科学，2012，39（22）：128-130.
[2]闫肃，吕嘉枥，郜洪涛.乳酸菌在食品工业中的应用[J].中国酿造，2010（12）：1-2.
[3]沙漠，逢焕明，古丽娜孜，李静，殷勇，杨海燕.自然发酵辣椒酱中乳酸菌的分离与鉴定[J].食品与机械，2012，28（1）：35-37.
[4]熊素玉，姚新奎，谭小海，刘珩，张积荣，曾波，许鹏，熊伟，吴津蓉.不同温度及pH条件对乳酸菌生长影响的研究[J].新疆农业科学，2006，43（6）：533―538.
[5]杨海英，张振宇，佐玉梅，杜刚.腌菜中乳酸菌的分离及产酸菌筛选研究[J].安徽农业科学，2012，40（13）：7909-7910，7915.
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