新型DNA-AgNCs在谷胱甘肽临床体外诊断中的应用研究

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　　 【摘要】 目的：以DNA为模板制备的水溶性银纳米簇（AgNCs）具有合成简单性质温和的特点，为拓展其在临床体外诊断中的应用，开展本次研究。方法：从四种缓冲液和三种DNA合成模板中筛选出最佳合成方案，制备具有良好荧光特性的DNA-AgNCs，并利用其对GSH和GGSH进行快速灵敏的体外检测，验证其在体外诊断中所发挥的作用。结果：合成的DNA-AgNCs荧光特性稳定，荧光光谱性质稳定，对GSH的检测具有很强的特异性，在0～10 μmol/L的范围内DNA-AgNCs的荧光强度与GSH的浓度成反比。结论：本研究为DNA-AgNCs在体外诊断中的应用带来了新的思路，拓展了其应用领域，其优异的荧光特性具有广阔的应用前景。
　　 【关键词】 银纳米簇 DNA 体外诊断荧光
　　 doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2019.28.028 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2019）28-00-03
　　 Application of Novel DNA-AgNCs in the Clinical Diagnosis of Glutathione in Vitro/XIA Haina， SHAO Wei. //Chinese and Foreign Medical Research， 2019， 17（28）： -70
　　 [Abstract] Objective： To explore the role that AgNCs can play in clinical in vitro diagnosis， and show the characteristics of simple synthesis and mildness that water-solubled silver nanoclusters （AgNCs） prepared by DNA template had， we conducted this study. Method： Selected the best synthesis scheme from four buffer solutions and three DNA synthesis templates， prepared DNA-AgNCs with good fluorescence characteristics， and used it for rapid and sensitive in vitro detection of GSH and GGSH to verify its role in vitro diagnosis. Result： The DNA-AgNCs had stable fluorescence characteristics and stable fluorescence spectra. The detection of GSH was highly specific， and the fluorescence intensity of DNA-AgNCs was inversely proportional to the concentration of GSH in the range of 0-10 μmol/L. Conclusion： Our study provides a new idea for the application of DNA-AgNCs in vitro diagnosis， expanded its application field， and its excellent fluorescence characteristics have broad application prospects.
　　 [Key words] AgNCs DNA IVD Fluorescence
　　 First-author’s address： Putuo District People’s Hospital in Zhoushan City， Zhoushan 316100， China
　　 銀纳米簇（sliver nanoclusters，AgNCs）是由几个到十几个银原子组成的纳米分子级聚集体，其往往是由有机配体或生物相容性材料作为稳定基团包裹形成的[1-2]。AgNCs与其他荧光金属纳米簇的一样，具有荧光强度高、抗光漂白性强、量子产率高、荧光波长可调[3]、生物毒性低等优点[4]，近年来在生物检测[5]、体外诊断、荧光示踪和细胞成像分析等领域受到了越来越广泛的关注[6]。谷胱甘肽是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的具有重要生理功能的天然活性肽，在体内有还原型和氧化性两种形态。还原型谷胱甘肽（glutathione reduced，GSH），具有清除自由基、解毒、保护肝脏、提高免疫力及抗癌等诸多作用，其半胱氨酸上的巯基是发挥其生物学功能所不可缺少的功能基团。谷胱甘肽的检测可以为病毒性肝炎、脑类疾病、免疫系统疾病等的诊断提供依据[7]。本研究首先探索了AgNCs的合成，由于温和地制备水溶性AgNCs并不容易，笔者选择以DNA为合成模板，并筛选了最佳的性质温和的缓冲体系，研究合成后的DNA-AgNCs作为体外诊断试剂在检测GSH中所发挥的作用。
　　1 材料与方法
　　1.1 一般材料
　　 （1）硝酸银（AgNO3）（购于Sigma公司）;（2）醋酸铵（CH3COONH4，NH4Ac）（购于Sigma公司）;（3）脱氧核糖核酸（DNA）模板链（购于Sangon上海分公司，经PAGE纯化），DNA1：5’-TTCCCACCCACCCCGGCCCGTT-3’;DNA2：5’-TATCCGTCCCCCACGGATA-3’;DNA3：5’-GCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG-3’;（4）硼氢化钠（NaBH）（购于aladdin公司）;（5）磷酸二氢钠（NaH2PO4）（购于Sigma公司）;（6）磷酸二氢钾（KH2PO4）（购于Sigma公司）;（7）磷酸氢二钠（Na2HPO4）（购于Sigma公司）;（8）氯化钾（KCl）（购于Sigma公司）;（9）氯化钠（NaCl）（购于Sigma公司）;（10）GSH（购于Sigma公司）;（11）氧化型谷胱甘肽（Glutathione oxidized，GSSG）（购于Sigma公司）。 　　1.2 方法
　　1.2.1 DNA-AgNCs的合成 4个不同的DNA合成组（1～4号分别为H2O对照组、DNA1模板组、DNA2模板组、DNA3模板组）分别加入H2O、PBS、低浓度NH4Ac（10 mmol/L NH4Ac）、高浓度NH4Ac（80 mmol/L NH4Ac）四种不同的缓冲体系中，再向体系中加入AgNO3溶液，三者充分混匀后放置于4 ℃冰箱中孵育20 min。随后向反应体系中加入NaBH4混匀，放置于4 ℃冰箱中反应1 h。反应完成后取样品测定其荧光强度，剩余样品在凝胶成像仪中拍照，随后放入冰箱中保存。
　　1.2.2 荧光检测方法 实验中，银纳米簇的荧光光谱用F7000荧光光谱仪检测，光谱仪的检测参数设置为：激发光波长570 nm，激发光光栅为2.5 nm，发射光范围580～800 nm，发射光接收光栅为2.5 nm，激发光电压为900 V。
　　1.2.3 GSH的检测 取DNA-AgNCs与不同浓度的GSH和GSSG水溶液等体积混合，混匀后将反应体系避光静置5 min，测定其荧光光谱。
　　2 结果
　　 本研究选择了一种耗时较短的合成方法，按缓冲体系的不同分为四组，通过凝胶成像仪拍摄的结果图1中可以看出，在10 mmol/L NH4Ac（图1A）、H2O（图1B）、pH 7.0 10 mmol/L PBS（图1C）、80 mmol/L NH4Ac（图1D）四种缓冲体系中，1～4号EP管中分别加入H2O（对照）及DNA1、DNA2、DNA3三种合成模板，在四组中均都只有加入DNA1的2号管中合成了具有荧光特性的DNA-AgNCs，因此，DNA1是研究所选的合成条件下，最佳的合成模板。
　　 从图1中还可以看出，在不同缓冲条件下，合成产物的荧光强度（亮度）有明显的不同，B、C两组荧光强度明显弱于A、D两组，但是较难区别A、D两组合成产物的荧光强度差异，因此研究选择通过荧光光谱检测区分二者的差异。最终结果显示A组缓冲体系合成的DNA-AgNCs荧光强度更高，最佳合成方案为在10 mmol/L NH4Ac中利用DNA1为模板合成DNA-AgNCs。
　　 通过一系列验证，最终选择A组缓冲中，利用DNA2为模板合成DNA-AgNCs，并且在合成后，用荧光光谱仪对其荧光特性做了荧光光谱表征，合成的DNA-AgNCs激发光波长为570 nm，发射光波长为630 nm。峰值不会随激发光的改变而偏移，合成产物荧光强度稳定，荧光效率强（图2）。
　　 本研究隨后利用合成的DNA-AgNCs对GSH进行了检测，因为GSH和GSSG在人体中是共同存在的，因此检测体系需要对二者进行区别（图3），从图中可以看出在0～10 μmol/L时GSSG对DNA-AgNCs的荧光强度几乎没有影响，GSH在人体血液中的含量约为371 mg/L，GSSG约为3.71 mg/L（约为6.05 μmol/L），通过图3的结果可以看出，在对实际样本检测时GSSG的存在不会对GSH的检测产生影响，因此，利用合成的DNA-AgNCs对GSH的检测是具有特异性的。
　　3 讨论
　　 光学纳米探针在疾病治疗、生物学成像、光学示踪和体外诊断等方面现在发挥了越来越大的作用[8-9]，金属荧光纳米簇由于具有特殊的光电学性质，近年来在体外诊断和影像学分析领域受到广泛的关注和研究，金银纳米簇是金属纳米簇中获得最多关注的研究对象。相比于金纳米簇，银纳米簇的应用研究，尚处于开始阶段，由于其具有合成简单、荧光量子产率高、荧光发射波长可调等优点，已经成为金属荧光纳米簇领域里具有良好发展前景的材料之一，在体外诊断、检测分析、荧光成像和示踪、生物标记等应用领域被广泛研究。
　　 与金纳米簇相比，在性质温和的水溶液中合成具有稳定荧光性质的银纳米簇相对要困难得多，这是由于在水溶液中AgNCs、自身趋向于团聚，使得新合成的AgNCs的体积会持续增长，从而变成大尺寸的纳米颗粒，丧失荧光特性。因此，在AgNCs合成中，需要降低表面能量，阻止其持续性增长，就需要选择与Ag/Ag+亲和力强的模板或抑制剂来合成，目前常用的模板分子有很多，比如，聚合物（聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚酰胺-胺树状分子等）、DNA、多肽和蛋白等[10]。从2004年Petty等[11]首次以DNA为模板制备了稳定性好、可溶于水的、荧光性质稳定的AgNCs，此后，越来越多文献报道DNA-AgNCs的合成及其应用。由于DNA模板可以灵活设计，合成简单快速，逐渐成为最受欢迎的AgNCs合成模板，随着研究工作的不断展开，研究人员发现DNA模板的长度和序列能够调控合成后的DNA-AgNCs的光学性质，能够产生稳定的光学差异，发射不同波长的荧光[12]。
　　 目前，DNA-AgNCs主要在疾病标志物诊断和荧光显影中进行应用研究，其中绝大部分都是利用其荧光的淬灭或增强检测离子等小分子、利用DNA的碱基互补配对特性来检测特定的DNA序列/单碱基突变或与DNA有关酶类的检测[13-15]。
　　 本研究利用合成的新型DNA-AgNCs用于检测生物活性小分子GSH，该分子是在1929年由Hopkins发现并命名的[7]，在生物体中有两种存在形式，GSH和GSSG，二者在正常人体内的比例大约为100∶1。通常所常指的谷胱甘肽是GSH，具有清除自由基、解毒、保护肝脏、提高免疫力及抗癌等诸多作用，谷胱甘肽的检测可以为病毒性肝炎、脑类疾病、免疫系统疾病等的诊断提供依据。
　　 通过研究结果可以发现，笔者合成的DNA-AgNCs的荧光性质稳定，荧光强度高，在GSH的检测中表现出了良好的特异性，能够作为GSH体外检测疾病诊断的检测试剂，同时，通过结果笔者还发现，DNA-AgNCs的合成对DNA模板和缓冲体系都有一定要求，这对今后探讨合成产物在荧光成像中的应用提供了基础，值得进一步研究。 　　参考文献
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　　（收稿日期：2019-05-05） （本文编辑：郎序莹）
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