长链非编码RNA-HOTAIR在曲妥珠单抗耐药细胞株中的表达变化研究

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　　 【摘要】 目的：研究长链非编码RNA-HOTAIR在曲妥珠单抗耐药细胞株与曲妥珠单抗敏感细胞株中的表达差异。方法：选取乳腺癌细胞系SK-BR-3-TS，通过间歇大剂量冲击和逐步增加劑量相结合的方法，诱导建立曲妥珠单抗耐药细胞系SK-BR-3-TR。qRT-PCR检测SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR细胞HOTAIR的表达情况。结果：在成功诱导及稳定培养乳腺癌曲妥珠单抗耐药细胞系SK-BR-3-TR中，HOTAIR RNA表达水平（2.216±0.332），明显高于曲妥珠单抗敏感细胞株SK-BR-3-TS的（0.326±0.050），差异有统计学意义（P=0.000 6）。结论：曲妥珠单抗耐药细胞株SK-BR-3-TR中HOTAIR表达明显上调。
　　 【关键词】 乳腺癌 HOTAIR 曲妥珠单抗 耐药 长链非编码RNA
　　 doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.12.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2020）12-000-03
　　 Study on the Expression Changes of Long Non-coding RNA-HOTAIR in Trastuzumab Resistant Cell Lines/WEI Panmei， ZHU Jing， CHEN Tianwen. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（12）： -3
　　 [Abstract] Objective： To study the expression difference of long non-coding RNA-HOTAIR in trastuzumab resistant cell lines and trastuzumab sensitive cell lines. Method： The breast cancer cell line SK-BR-3-TS was selected and the trastuzumab resistant cell line SK-BR-3-TR was induced by the combination of intermittent large dose shock and gradually increasing dose. HOTAIR expression was detected in the SK-BR-3-TS and SK-BR-3-TR cell lines by qRT-PCR. Result： In the successful induction and stable culture of trastuzumab resistant breast cancer cell line SK-BR-3-TR， the expression level of HOTAIR RNA （2.216±0.332） was significantly higher than （0.326±0.050） of trastuzumab sensitive cell line SK-BR-3-TS， and the difference was statistically significant
　　（P=0.000 6）. Conclusion： The expression of HOTAIR is significantly up-regulated in trastuzumab resistant breast cancer cell lines SK-BR-3-TR.
　　 [Key words] Breast cancer HOTAIR Trastuzumab Drug resistance Long non-coding RNA
　　 First-author’s address： Huazhong University of Science & Technology Union Shenzhen Hospital， Shenzhen 518000， China
　　 HER2阳性分子亚型乳腺癌占所有乳腺癌的20%～25%，此亚型乳腺癌因具有高增殖能力、富侵袭性、易远处转移等生物学特征，患者预后较差[1]。曲妥珠单抗耐药是HER2阳性乳腺癌治疗失败的重要因素之一，深入研究曲妥珠单抗耐药机制，寻找潜在治疗靶点，克服其耐药是改善HER2阳性乳腺癌患者生存的重要途径[2]。近年来，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）与恶性肿瘤的关系研究已成为肿瘤研究领域的热点之一，与恶性肿瘤的发生发展及药物抵抗有关[3]。同源异形盒转录反义RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是一种包含2 158个核苷酸的基因间长链非编码RNA。研究表明，HOTAIR与乳腺癌的发生发展、肿瘤细胞的侵袭转移及患者预后相关[4-5]。近些年来，有多项体外研究及回顾性临床研究结果提示，HOTAIR与肺癌、宫颈癌、卵巢癌铂类化疗耐药相关[6-8]。在乳腺癌中，一项研究提示，HOTAIR在多个ER阳性、他莫昔芬耐药乳腺癌细胞系及乳腺癌他莫昔芬治疗失败的复发转移组织标本中均高表达[9]，进一步体外研究揭示，HOTAIR在雌激素剥夺的乳腺癌他莫昔芬耐药细胞株中仍然高表达，通过上调耐药细胞ER受体表达参与他莫昔芬耐药。然而，HOTAIR与乳腺癌曲妥珠单抗耐药的相关研究目前未见报道，本研究旨在检测曲妥珠单抗耐药细胞株中HOTAIR的表达情况，从而为进一步研究HOTAIR与乳腺癌曲妥珠单抗耐药的相关性机制提供初步理论基础，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　 选取乳腺癌细胞系SK-BR-3-TS，通过间歇大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法，诱导建立曲妥珠单抗耐药细胞系SK-BR-3-TR。qRT-PCR检测SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR细胞HOTAIR的表达，MTT法检测两种细胞模型肿瘤细胞的增殖活性，具体如下。 　　1.1 SK-BR-3-TR细胞的制备及稳定培养
　　 SK-BR-3细胞系来自美国ATCC公司，曲妥珠单抗（Trastazumab）来自中国上海罗氏制药有限公司。采用间隙大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法，诱导建立曲妥珠单抗耐药SK-BR-3-TR细胞模型，具体如下：（1）取处于对数生长期SK-BR-3-TS细胞，在完全培养基中加入0.5 μg/ml（约10倍的50%抑制浓度）曲妥珠单抗，直至细胞能在0.5 μg/ml曲妥珠单抗条件下稳定生长;（2）之后逐步增加药物浓度，使细胞依次在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/ml曲妥珠单抗环境下稳定生长和传代;（3）诱导细胞在8 μg/ml曲妥珠单抗环境下稳定生长和传代1个月后，获得SK-BR-3-TR细胞;（4）之后将SK-BR-3-TR细胞在含4.0 μg/ml完全培养基中培养。整个耐药诱导时间约7个月。
　　1.2 SK-BR-3-TR细胞的鉴定
　　 MTT法检测不同浓度曲妥珠单抗干预下SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR细胞增殖能力。（1）种板：取对数生长期SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR细胞，胰酶消化，血清终止反应，离心去上清，完全培养液重悬细胞，血球计数板计算细胞数，以
　　3 000个/孔接种于96孔板;（2）加药：培养24 h、细胞贴壁后去上清，加入含有曲妥珠单抗浓度药物的完全培养基，200 μl/孔，其中药物终浓度分别为0、2、4、6 μg/ml和8 μg/ml，其中0 μg/ml为对照组，不含细胞的完全培养基为调零孔，每组设6个复孔;（3）加入MTT：培养箱内培养24 h后，加入MTT工作液，20 μl/孔，其终浓度为5 μg/ml，培养箱内避光孵育4 h;（4）溶解：取出培养板，避光去上清，每孔加入150 μl DMSO，避光振荡溶解5 min;（5）检测：酶标仪中，490 nm波长处检测吸光值;（6）分析：取每组吸光值平均值，绘制细胞活性曲线。细胞增殖率按照以下公式计算：增殖率（或者细胞活性）=（试验组OD值-调零孔OD值）/（对照组OD值-调零孔OD值）。
　　 按照Trizol Reagent说明书进行细胞总RNA的提取，对比RNA的变化。
　　1.3 统计学处理
　　 本研究数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析和处理，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 曲妥珠单抗耐药细胞SK-BR-3-TR的成功诱导和稳定培养
　　 在间歇大剂量冲击过程中，首先诱导出能够在较低浓度曲妥珠单抗下繁殖、稳定生长传代的耐药克隆;之后逐步增加曲妥珠单抗剂量，细胞再次经历凋亡、耐药克隆形成并生长过程，直至筛选出能在8 μg/ml曲妥珠单抗环境下稳定生长的细胞克隆，见图1。
　　2.2 不同浓度曲妥珠单抗干预下SK-BR-3-TS和SK-BR-3-TR细胞活性检测
　　 MTT法检测结果表明，不同浓度曲妥珠单抗作用24 h后，SK-BR-3-TS细胞增殖能力随药物浓度升高而逐渐降低，而SK-BR-3-TR细胞增殖活性随药物浓度升高未发生明显变化。与对照组相比，4 μg/ml作用24 h后，SK-BR-3-TS活性降低接近40%（0.63±0.03），而SK-BR-3-TR细胞未发生显著变化（0.94±0.05）;进一步升高度曲妥珠单抗浓度至8 μg/ml对SK-BR-3-TR细胞增殖活性仍无显著影响（0.84±0.03），但SK-BR-3-TS活性進一步被降低（0.19±0.01），见图2。
　　2.3 SK-BR-3-TR中HOTAIR的RNA表达水平明显上调
　　 在本试验中发现，HOTAIR的表达水平在曲妥珠单抗敏感细胞株SK-BR-3-TS中较低（0.326±0.050），而在曲妥珠单抗耐药细胞株SK-BR-3-TR中其表达量明显上调（2.216±0.332），差异有统计学意义（P=0.000 6），见图3。
　　3 讨论
　　 成功诱导及稳定培养曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞系，是开展耐药相关研究的基础。Nahta等[9]应用大剂量（4 μg/ml和8 μg/ml，80倍和160倍的50%抑瘤浓度）持续冲击诱导SK-BR-3-TS细胞3个月的方法，成功获得曲妥珠单抗耐药细胞模型。本试验在预试验期间，采用上述方法诱导细胞耐药，耐药克隆形成密度低，耐药细胞集落少，后来改良采用间歇大剂量冲击联合逐步增加剂量（初始剂量0.5 μg/ml，10倍的50%抑瘤浓度，阶梯式增加2倍浓度直至8 μg/ml）的方法，同时诱导过程中根据细胞克隆形成情况，间歇地往细胞培养液中补充一定量的亲代细胞，整个诱导时间6个月，于含4 μg/ml曲妥珠单抗培养液中稳定培养1个月，成功获得及稳定培养曲妥珠单抗获得性耐药细胞系SK-BR-3-TR，此结果证实，间歇大剂量冲击和逐步增加剂量相结合的方法可成功诱导SK-BR-3-TS对曲妥珠单抗耐药。这为下一步研究奠定了基础。
　　 长链非编码RNA是指一类长度超过200个核苷酸，无蛋白质编码功能但具有表观遗传调控等多个生物学功能的RNA分子，与恶性肿瘤的发生发展及药物抵抗有关[3，10-11]。HOTAIR是第一个被发现具有反式转录调控作用的长链非编码RNA，长约2 158 nt，位于哺乳动物基因组12q上HOXC位点[12]。Rinn等[13]首次发现HOTAIR通过表观遗传学调控基因的表达，作用方式类似于脚手架。一方面，HOTAIR 5’端结合染色质多梳蛋白抑制复合体（polycomb repressive complex 2，PRC2）。PRC2主要由甲基转移酶EZH2、SUZ12和EED3个亚基组成，可介导H3K27的三甲基化进而沉默特定基因的转录。另一方面，HOTAIR3’端可结合组蛋白去甲基化酶1（lysinespecific demethylase 1， LSD1）复合体（LSDl/CoREST/REST），介导H3K4me2的去甲基化，调节靶基因的转录激活。乳腺癌体外研究及全基因组学研究结果提示，HOTAIR通过募集PRC2和LSD1复合体到乳腺癌细胞靶基因启动子区，导致包括TGF-β、JAK/STAT、PI3K/AKT、PTEN等信号通路相关基因在内的850多个基因表达发生变化，促进了乳腺癌细胞的侵袭转移[4]。另有研究提示，HOTAIR还参与了乳腺癌上皮间质转化进程，且与乳腺癌细胞干性维持有关[14-17]。Li等[18]在人喉鳞状细胞癌模型中研究发现，HOTAIR能引起PTEN甲基化，下调PTEN蛋白表达，从而导致PI3K/AKT通路活性增强，促进癌细胞的增殖和转移。 　　 本课题应用HER2阳性、曲妥珠单抗敏感的乳腺癌细胞系SK-BR-3成功诱导及稳定培养曲妥珠单抗获得性耐药细胞SK-BR-3-TR，通过检测发现耐药细胞较亲代细胞HOTAIR表达明显上调，这提示HOTAIR可能在SK-BR-3-TR细胞曲妥珠单抗耐药中发挥作用。这一结果为进一步探讨HOTAIR与乳腺癌曲妥珠单抗耐药的关系及分子机制提供了初步的理论依据。
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　　（收稿日期：2019-12-17） （本文编辑：桑茹南）
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