高效液相色谱法测定产后坐月膏中芍药苷的含量
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[摘要]目的 建立高效液相色谱法测定产后坐月膏中白芍有效成分芍药苷含量的方法。方法 采用高效液相色谱法测定产后坐月膏中芍药苷的含量，色谱柱为Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100A）或Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（14∶86），检测波长为230 nm，流速为1.0 ml/min。结果 芍药苷的检测浓度在1.93～38.60 μg/μl范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r=0.9999），平均回收率为99.96%，RSD=0.81%（n=9）。结论 本方法简单、准确、重复性好，可用于产后坐月膏的质量控制。
[关键词]产后坐月膏;高效液相色谱法;芍药苷;质量控制
[中图分类号] R244 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2020）7（b）-0026-04
Content determination of paeoniflorin in Chanhou Zuoyue Paste by high performance liquid chromatography
DENG Li-chang1 WU Sheng-zhen1 WU Su-zhen1 HONG Mei-hua2 WU Lin-fu2
1. Central Hospital in Chancheng District of Foshan City， Guangdong Province， Foshan 528000， China; 2. Food and Drug Inspection Institute， Guangdong Province， Shanwei 516600， China
[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography method for the determination of paeoniflorin in Raidix Paeoniae Alba in Chanhou Zuoyue Paste. Methods High performance liquid chromatography was used to determine the content of paeoniflorin in Chanhou Zuoyue Paste， the chromatographic columns were Venusil MP C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm， 100A） or Diamonsil C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）. The mobile phase was acetonitrile-water （14∶86）， the detection wavelength was 230 nm， and the flow rate was 1.0 ml/min. Results The detection concentration of paeoniflorin in the range of 1.93-38.60 μg/μl showed a good linear relationship with the peak area integral value （r=0.9999）， the average recovery was 99.96%， RSD was 0.81% （n=9）. Conclusion This method is simple， accurate， and reproducible， it can be used for the quality control of Chanhou Zuoyue Paste.
[Key words] Chanhou Zuoyue Paste; High performance liquid chromatography; Paeoniflorin; Quality control
產后坐月膏是由黄芪、白芍、当归、熟地黄、益母草等中药材组成的中药复方制剂，具有补气养血、祛瘀生新、益肾填精的功效，适用于产后气血俱损，多虚、多瘀、多虑导致的肢体困倦，面色无华，腰膝酸痛，四肢冰冷，恶露不尽及产后抑郁等证属肾精不足、气血两虚的人群。白芍的临床应用十分广泛[1]，主要功效为平肝止痛、养血调经、敛阴止汗，用于治疗头痛眩晕、腹痛、胁痛[2]。白芍在膏方中列为臣药，芍药苷是白芍的主要成分[3]，也是白芍的特征成分[4]，成分清楚，芍药苷的含量较高[5-6]，采用高效液相色谱法测定芍药苷的含量[7-8]，结果准确、重现性好[9-10]。故本研究参照《中国药典》2015版一部药材白芍项下的含量测定方法[11]，采用高效液相色谱法[12]测定产后坐月膏中白芍主成分芍药苷的含量，旨在更好地控制药品的内在质量，现报道如下。
1仪器与试药
1.1仪器
LC-20AT型高效液相色谱仪、SPD-M20A检测器（日本岛津）;2405型紫外分光光度计（日本岛津）;KQ-300DE型超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司，功率300 W，频率40 kHz）;CPA324S型、CP225D型电子天平（赛多利斯）。
1.2试药
对照品购买于中国药品生物制品检定所：芍药苷对照品（批号：110736-201943）;样品3批（50 g/瓶，批号：20190310、20190420、20190508）及阴性对照，均为广东省佛山市禅城区中心医院国医国药馆出品;乙腈（色谱纯，美国默克公司）;水（超纯水，实验室自制）。其他试剂均为分析纯。 1.3 C18色谱柱
Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100A），Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。
2方法及结果
2.1色谱条件
色谱柱：Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100A）或Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相：乙腈-水（14∶86）;检测波长：230 nm;流速：1.0 ml/min;进样量：10 μl。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000。
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品约10 mg，置500 ml量瓶中，加稀乙醇适量溶解，加稀乙醇至刻度，摇匀，得20 μg/ml的对照品溶液。
2.2.2供试品溶液的制备 精密称取样品约1.0 g，置250 ml量瓶中，加稀乙醇适量，超声处理30 min（功率300 W，频率40 kHz），放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.2.3阴性对照溶液的制备 精密称取缺少白芍的阴性对照1.0 g，同“2.2.2”项下方法制备，即可得阴性对照溶液。
2.3专属性考察
分别精密吸取“2.2.1”项的对照品溶液、“2.2.2”项的供试品溶液、“2.2.3”项的缺白芍阴性对照溶液及空白溶剂，按“2.1”项的色谱条件进样，记录色谱图，分别见图1～4。结果显示，阴性对照溶液色谱图在芍药苷对照品相应保留时间（19.290 min处）无吸收峰（图3），表明处方中其他成分无干扰，专属性好。
2.4线性范围考察
精密称取芍药苷对照品19.30 mg，加稀乙醇溶解并稀释10 ml，摇匀作为芍药苷对照品储备液（1.93 mg/ml），分别精密吸取对照品储备液1、5、10、15、20 μl（1.93、9.65、19.30、28.95、38.60 μg/μl），测定峰面积。以芍药苷浓度（μg/μl）为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y），制作标准曲线，得到回归方程为：Y=0.0138X-0.8569（r=0.9999），结果表明，芍药苷浓度在1.93～38.60 μg/μl的范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
2.5精密度考察
2.5.1重复性试验 精密称取样品（批号：20190310）6份，各约1.0 g，按“2.2.2”项下的供试品溶液制备方法制备溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定，测得平均含量为5.64 mg/g，RSD=0.98%（n=6），表明该方法重复性良好。
2.5.2中间精密度考察 由广东省佛山市禅城区中心医院“低温提取浓缩系统制备中药膏方的工艺及其稳定性研究”课题组3个人，分别取样品（批号：20190310）约1.0 g，按“2.2.2”项下的方法“置250 ml量瓶中”起同法制备供试品溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定，结果显示，平均含量为5.59 mg/ml，RSD=1.02%，表明该方法重现性好。
2.6稳定性考察 取相同的“2.2.2”项下的供试品溶液，分别于24 h内每隔3 h，按“2.1”项的色谱条件进行测定，记录峰面积，测定结果显示，峰面积无明显的变化，RSD=0.52%（n=8），表明样品溶液在24 h内稳定性良好。
2.7加样回收率考察
精密量取样品（批号：20190310）9份，各约1.0 g，分成高、中、低3组，精密加入芍药苷对照品溶液（0.263 mg/ml）各5.0、10.0、15.0 ml，再按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定。加样回收数据结果见表1。结果显示，平均回收率为99.96%，RSD=0.81。
2.8方法耐用性考察
2.8.1检测波长的确定 取芍药苷对照品溶液（20 μg/ml）于200～400 nm波长进行紫外扫描，结果表明，最大吸收波长为229.60 nm，故确定方法的测定波长为230.0 nm。
2.8.2提取时间的考察 分别精密称取样品（批号：2019 0310）4份，各約1.0 g，加稀乙醇适量，分别用20、30、40 min及1 h超声提取，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，按照“2.1”项的色谱条件进行测定。结果显示，芍药苷含量分别为：5.51、5.62、5.69、5.66 mg/g，表明稀乙醇不同提取时间的芍药苷含量基本一致，考虑实验效率和充分溶解，确定以中位值（超声提取30 min）为拟定方法。
2.8.3色谱柱考察 分别使用不同品牌的色谱柱，Venusil MP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，100A），Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）进行检测，结果显示其各项色谱指标等均达到液相色谱测定法的要求。
2.9样品的测定
分别取3个批号的样品，按“2.1”项的色谱条件进行芍药苷的含量测定，测定结果分别为：5.64 mg/g（20190310）、5.02 mg/g（20190420）、5.31 mg/g（20190508）。
3讨论
本研究中，提取溶剂曾分别考察乙醇、稀乙醇、1%盐酸稀乙醇，同法测定含量，结果稀乙醇的溶出量最大，拟定提取溶剂为稀乙醇[13-14]。流动相曾考察了乙晴-0.1%磷酸溶液（14∶86）、乙腈-水（14∶86）两个流动相系统，结果显示在乙腈-水（14∶86）系统中，样品分离度符合要求，故拟定流动相系统选择乙腈-水（14∶86）[15-16]。流速曾考察了0.5、1.0 ml/min，以1.0 ml/min 流速分离度好，故选择流速为1.0 ml/min[17-18]。 高效液相色谱法法测定产后坐月膏中芍药苷的含量，方法简单、准确，能有效控制产品的内在质量。
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（收稿日期：2020-02-25）
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