AGAP2-AS1对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响

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　　[摘要] 目的 探究AGAP2-AS1在结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响。 方法 从美国TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库结直肠数据下载结肠癌患者的RNA-Seq数据。通过TCGA数据库获得356例结直肠癌，145例健康样本，通过定量实时PCR（Polymerase Chain Reaction）检测结直肠癌细胞和正常肠黏膜上皮细胞AGAP2-AS1表达水平。用siRNA（Small interfering RNA）抑制结直肠癌细胞中AGAP2-AS1的表达，再次分析其细胞增殖、凋亡的改变。 结果 AGAP2-AS1在结肠癌组织和细胞中表达均显著增加。抑制AGAP2-AS1后肿瘤细胞增殖能力显著降低，凋亡显著增加（P<0.05）。 结论 AGAP2-AS1在结肠癌细胞系中高表达，抑制AGAP2-AS1表达可抑制结肠癌细胞增殖，并诱导其凋亡。
　　[关键词] 结肠癌;AGAP2-AS1;增殖;凋亡
　　[中图分类号] R735.35          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）23-0020-04
　　Effects of AGAP2-AS1 on proliferation and apoptosis of colon cancer cells
　　HE Liu   WU Shenbao
　　Department of Gastroenterology， Yiwu Central Hospital in Zhejiang Province， Yiwu   322000， China
　　[Abstract] Objective To investigate the expression of AGAP2-AS1 in colon cancer and its effect on the proliferation and apoptosis of colon cancer cells. Methods The colorectal cancer RNA-Seq data were downloaded from The Cancer Genome Atlas（TCGA） database. A total of 356 cases of colorectal cancer and 145 healthy samples were obtained from TCGA. The expression of AGAP2-AS1 in colorectal cancer cells and normal intestinal epithelial cells was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction（PCR）. Small interfering RNA（siRNA） was used to inhibit the expression of AGAP2-AS1 in colorectal cancer cells， and the changes of its proliferation and apoptosis were further analyzed. Results The expression of AGAP2-AS1 was significantly increased in colon cancer tissues and cells. After AGAP2-AS1 was inhibited， the proliferation of tumor cells was significantly reduced and apoptosis was significantly increased（P<0.05）. Conclusion AGAP2-AS1 is highly expressed in colon cancer cell lines. Inhibition of AGAP2-AS1 expression can inhibit the proliferation of colon cancer cells and induce their apoptosis.
　　[Key words] Colon cancer; AGAP2-AS1; Proliferation; Apoptosis
　　結肠癌（Colorectal cancer，CRC）作为消化系统最常见的肿瘤之一，发生率仅次于肺癌和肝癌，在我国及全世界都非常常见，每年我国死于结肠癌的患者10万以上，且结肠癌患者的死亡率有逐渐上升的趋势[1]。现在随着医疗、卫生技术的飞速发展，新的诊疗技术不断出现，结肠癌的诊治水平有了明显提高。然而，由于目前人们还缺乏体检意识，且早期结肠癌并无明显特征性表现，故众多患者在确诊结肠癌时已经处于晚期，且伴多处转移，对于转移性结肠癌的患者来说，以往多采用单纯化疗，然而疗效往往不尽人意[2]，近年来，靶向治疗作为一种新兴的治疗方式正在逐渐被临床医师所认可，因此特异性生物标志物和治疗靶点的研究显得十分重要[3]。
　　AGAP2-AS1是一种定位于12q14.1的反义lncRNA（long noncoding RNA），现有多项研究发现，AGAP2-AS1在多种肿瘤细胞中的表达失调，并与恶性肿瘤的临床预后相关。然而，AGAP2-AS1在CRC中的表达及其作用报道较少[4]。因此，本研究旨在探究AGAP2-AS1在结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响，现报道如下。 　　1 资料和方法
　　1.1 TCGA结直肠RNA-Seq数据
　　从美国TCGA（The Cancer Genome Atlas） 数据库结直肠数据下载结肠癌患者的RNA-Seq数据[5]。
　　1.2 材料和细胞培养
　　人CRC细胞系（SW480、HCT-116细胞）和人结肠黏膜上皮细胞（NCM460）购自中国科学院细胞库（中国上海）。10%胎牛血清（TBD公司），DMEM培养液（美国Gibco公司），CO2无菌培养箱（美国Thermo公司）;AGAP2-AS1的si-RNA慢病毒（si-AGAP2-AS1）、对照（si-NC）、TRIzol试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green预混液（TaKaRa公司，日本），CCK8试剂盒（Dojindo公司，日本）。
　　细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基（Invitrogen公司）中，置于37℃、CO2培养箱中，间隔2 d更换培养基1次。
　　1.3 定量实时PCR
　　根据说明书实验步骤，使用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA。首先，使用SuperScript IV逆转录酶（Thermo Fisher Scientific）进行逆转录以合成cDNA后，在Applied Biosystems 7500实时PCR系统（ABI，美国）上使用PrimeScript RT Master Mix（Takara，大连）进行PCR 测定。所有反应一式三份进行，并选择2-△△Ct方法用于分析AFAP1-AS1相对表达水平。18S rRNA分别用作mRNA的内部参考。用2-△△Ct法分析相對表达。所有实验一式三份进行。引物序列为对AGAP2-AS1，5'-TACCTTGACCTTGCTGCTCTC-3'（正向）和5'-TGTCCCTTAATGACCCCATCC-3'（反向）;18S rRNA，5'-CTTAATTTGACTCAACACGGGA-3'（正向）和5'-AGCTATCAATCTGTCAATCCTGT-3'（反向）。
　　1.4 细胞转染
　　依据操作手册，从GenePharma（上海）购买特异性靶向AGAP2-AS1（si-AGAP2-AS1）和阴性对照siRNA（si-NC），使用Lipofectamine 3000 Reagents（Invitrogen）将这些质粒转染到细胞系中[6]。
　　1.5 CCK-8 法测定细胞增殖能力
　　通过CCK-8试剂盒评估不同组的细胞增殖率。将特异性靶向AGAP2-AS1（si-AGAP2-AS1）和阴性对照siRNA（si-NC）两组细胞（密度每孔1×104个细胞）接种到96孔板中，各组细胞经胰酶消化后，重悬于完全培养基中，调整浓度至10个/μL后，继续培养0、24、48、72 h，分别加入10%CCK-8溶液。然后，将10 μL CCK-8溶液加入每个孔中，并将细胞在37℃、5%CO2下再保持1～2 h。最后，使用分光光度计测量450 nm处的吸光度，以代表细胞增殖能力，连续测量5 d[7]。
　　1.6 流式细胞术
　　通过流式细胞术分析测量细胞凋亡。将用si-AGAP2-AS1和si-NC转染的细胞分别放入6孔板中，加入不含血清的RPMI培养基饥饿24 h后重新加入完全培养基中培养24 h。随后，使用PBS洗涤并重悬细胞。然后，使用膜联蛋白V-FITC和PI在室温下（避光）染色细胞15 min。用流式细胞仪检查细胞群[8]。
　　1.7 统计学方法
　　使用SPSS21.0统计学软件进行分析。所有计量资料用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 TCGA数据库中AGAP2-AS1在CRC组织中的表达情况及小干扰序列在CRC细胞系中的干扰效率
　　通过TCGA数据库获得356例结直肠癌，145例健康样本，其中CRC组织中AGAP2-AS表达水平为（3.177±0.185），而正常组织中表达水平为（1.003±0.088）。其表达水平显著上调（P<0.01），两者差异具有统计学意义（图1）。通过siRNA成功抑制结肠癌细胞中AGAP2-AS1表达，通过 qRT PCR 实验发现转染了siRNA的细胞AGAP2-AS1表达水平明显低于转染siRNA的si-NC组，表达量下调近50%，差异有统计学意义（P<0.05）（图2），可满足后续实验。
　　2.2 干扰AGAP2-AS表达抑制结肠癌细胞增殖和诱导凋亡
　　然后通过CCK8检测CRC组及si-NC组的吸光度，CCK8实验结果显示，转染0、24、48、72 h后，si-NC组吸光度值分别为（0.5007±0.0035）、（1.0356±0.0097）、（1.3273±0.0081）、（1.6953±0.0073）;si-AGAP2-AS1组吸光度值分别为（0.4523±0.0031）、（0.8526±0.0065）、（1.0402±0.0086）、（1.1663±0.0202）;两组吸光度值比较差异均有统计学意义（P<0.05）。AGAP2-AS1干扰组吸光度明显减低（P<0.05）（图3）;且随着时间的推移，干扰组和对照组的吸光度差异逐渐增大（图3）;同时流式细胞术实验显示，细胞凋亡数量由（181±14）升至（369±15），其凋亡显著增加，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。
　　3 讨论
　　结肠癌发病率仅次于肺癌及肝癌，在全世界非常常见，目前全球每年新增确诊结肠癌例数在120万左右，然而由于国内人们体检意识不强，且结肠癌早期无明显特异性临床表现，仅表现为排便习惯改变，故很多患者在被确诊为结肠癌时已经处于晚期。因此寻找关键的特异性生物标志物对于肿瘤的诊断、治疗和预后至关重要[9-11]。 　　近年来，随着科学技术的飞速发展，基因技术已逐渐被广泛运用，以RNA测序技术为代表，越来越多的LncRNA在肿瘤的发生、发展、增殖、侵袭、凋亡中起到关键的调控作用，长链非编码RNA SNHG1可通过顺式作用、反式作用，结合Mediator complex，促进SLC3A2基因的转录，又通过与转录因子FUBP1结合阻遏其与抑制蛋白FIR结合，因此达到促进结直肠肿瘤细胞的增殖与发展。LncRNA BLACAT1通过下调P15进而促进结肠恶性肿瘤细胞增殖。因此多种lncRNA被用作肿瘤诊断的生物标志物。寻找关键的lncRNA并了解其机制对于肿瘤的诊断、治疗和预后至关重要。更重要的是，lncRNA被认為是结肠癌早期诊断和预后的新型重要生物标志物。
　　AGAP2-AS1是一种定位于12q14.1的反义lncRNA，现有多项研究发现，AGAP2-AS1在多种肿瘤细胞中表达失调，并与恶性肿瘤的临床预后相关[12]，最新研究显示，SATB2-AS1通过抑制SATB2依赖性Snail表达和上皮-间质转化从而抑制结肠直肠癌的侵袭性。LncRNA -ZDHHC8P1可以通过靶向调控miR-34a，促进结肠直肠癌的进展和转移。研究显示，LncRNA AFAP1-AS1敲除导致CRC细胞增殖和集落形成的抑制。过表达AGAP2-AS1通过与非小细胞肺癌细胞中的EZH2和LSD1相互作用，抑制LATS2和KLF2的表达，其过表达与恶性临床特征和预后相关[13]。此外，AGAP2-AS1通过靶向调控miR-34a促进结肠直肠癌的进展和转移。AGAP2-AS1敲除导致CRC细胞增殖和集落形成的抑制[14]。同时，诱导CRC细胞中的G0/G1细胞周期停滞。研究者同时发现其过度表达与预后不良相关，从而在结直肠癌的肿瘤发生中发挥重要作用。过表达lncRNA HOTAIRM1可以增加HOXA1表达，促进胶质母细胞瘤的增殖和转移。有研究证实lncRNA PANDAR可以通过p53途径增加卵巢癌的耐药性。同时，lncRNA-p21通过调节EZH2/STAT3信号传导可以调控抗雄激素诱导的前列腺癌神经内分泌分化，有助于临床去势抵抗性前列腺癌的治疗。尽管AGAP2-AS1 已经在各种肿瘤被广泛研究报道，但是AGAP2-AS1在结肠癌患者中鲜有报道。因此，本研究旨在探究AGAP2-AS1在结肠癌组织中的表达及对结肠癌细胞增殖、凋亡的影响[15-19]。
　　本研究通过TCGA数据库分析了AGAP2-AS1在结直肠癌中的表达，发现相比较于145健康正常样本，在356例结肠癌中AGAP2-AS1表达显著上调。随后，本文通过siRNA成功干扰肿瘤细胞AGAP2-AS1表达后，通过CCK8试剂盒和流式细胞技术证实，结肠肿瘤细胞增殖能力下降，且细胞凋亡显著增多。
　　综上所述，AGAP2-AS1在结肠癌细胞中高表达，抑制AGAP2-AS1表达可抑制结肠癌细胞增殖，并诱导其凋亡。因此，AGAP2-AS1有望成为结肠癌预后判断的一个新型生物标志物，对于结直肠癌的早期诊断和诊疗方案具有重要意义[20-21]。
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　　（收稿日期：2019-11-14）
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