TRIM32过表达对MCF-7乳腺癌细胞增殖、浸润和侵袭的影响
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摘要：目的 探讨TRIM32过表达对MCF-7乳腺癌细胞增殖、浸润和侵袭的影响。方法 应用Western blot、CCK-8、Transwell和wound healing实验分析TRIM32过表达对MCF-7细胞增殖、浸润和侵袭影响。结果 Western blot实验显示，TRIM32在MCF-10A正常乳腺上皮细胞中低表达，而在MCF-7乳腺癌细胞中高表达（P<0.05）;与空白对照组比较，MCF-7细胞中转染TRIM32质粒后TRIM32呈过表达（P<0.05）;CCK-8实验显示，与空白对照组比较，TRIM32过表达后MCF-7细胞增殖率提高（P<0.05）。Transwell实验显示，与空白对照组比较，过表达TRIM32后MCF-7乳腺癌细胞穿孔数目增加（P<0.05）;Wound healing实验显示，与空白对照组比较，过表达TRIM32后MCF-7乳腺癌细胞12、24 h的迁移距离增加（P<0.05）。结论 TRIM32在乳腺癌细胞中高表达，过表达TRIM32促进乳腺癌细胞增殖、浸润和侵袭能力，其可能成为乳腺癌治疗的新靶点。
关键词：TRIM32;过表达;乳腺癌
中图分类号：R737.9 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.04.026
文章编号：1006-1959（2020）04-0087-03
Abstract：Objective To investigate the effect of TRIM32 overexpression on the proliferation， infiltration and invasion of MCF-7 breast cancer cells. Methods Western blot， CCK-8， Transwell and wound healing experiments were used to analyze the effects of TRIM32 overexpression on MCF-7 cell proliferation， infiltration and invasion.Results Western blot experiments showed that TRIM32 was low-expressed in MCF-10A normal breast epithelial cells and high-expressed in MCF-7 breast cancer cells（P<0.05）. Compared with the blank control group， MCF-7 cells were transfected with TRIM32 plasmid TRIM32 was over-expressed （P<0.05）; CCK-8 experiments showed that compared with the blank control group， the proliferation rate of MCF-7 cells increased after TRIM32 over-expression （P<0.05）. Transwell experiments showed that MCF-7 breast cancer cell perforations increased after overexpression of TRIM32 compared with the blank control group（P<0.05）; Wound healing experiments showed that compared with the blank control group， MCF-7 breast cancer cells overexpressed TRIM32 migration distance at 12 and 24 h increased（P<0.05）.Conclusion TRIM32 is highly expressed in breast cancer cells， and overexpression of TRIM32 promotes breast cancer cell proliferation， infiltration and invasion ability， which may become a new target for breast cancer treatment.
Key words：TRIM32;Overexpression;Breast cancer
乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的恶性肿瘤，也是导致女性癌症死亡的第2位因素。传统治疗方法包括手术、放疗和化疗，虽然在很大程度上提高了患者生存率，但是死亡率仍然很高，因此研究乳腺癌发病和侵袭的分子机制将有助于乳腺癌的靶向治疗。TRIM32是TRIM家族成员之一[1]，其参与调控细胞的增殖、分化、发育、凋亡以及肿瘤的发生和发展过程[2，3]。有研究报道[4]，TRIM32通过活化β-catenin信号通路促进胃癌细胞增殖、浸润和侵袭。另有研究报道[5]，TRIM32高表达可促进肝细胞癌增殖。但TRIM32在乳腺癌细胞中的具体作用尚未明确。本研究旨在探讨TRIM32过表达对MCF-7乳腺癌增殖、浸润和侵袭的影响，现报道如下。 1材料与方法
1.1主要药品与试剂 10%胎牛血清、DMEM细胞培養基、胰酶、青-链霉素、PBS购自美国Hyclone公司;TRIM32兔多克隆抗体、GAPDH抗体、羊抗兔二抗购于美国proteintech公司;Lipofectamine 3000试剂盒和ECL显色试剂盒购于美国赛默飞公司;基质胶购于美国BD公司;Transwell小室购于美国康宁公司;CCK-8试剂盒购于上海碧云天生物公司;TRIM32过表达及空白对照质粒由上海吉玛生物公司合成;正常乳腺上皮细胞MCF-10A和乳腺癌MCF-7细胞为大连医科大学附属大连市中心医院病理科保存。
1.2方法
1.2.1细胞培养和转染 将MCF-10A和MCF-7细胞用含10%胎牛血清及100 IU/ml青-链霉素的DMEM培养基放入5%的CO2恒温恒湿培养箱中培养，细胞密度达到90%左右时，胰酶消化，进而传代及转染。转染步骤按照Lipofectamine 3000试剂盒说明书进行。
1.2.2 Western blot实验 用裂解液提取细胞蛋白，根据Bradford方法对蛋白定量，将蛋白提取液与上样缓冲液混匀煮沸，上样，SDS-PAGE电泳，PVDF膜转印，3% BSA封闭，TRIM32及GAPDH一抗（1∶1000）4℃孵育过夜，羊抗兔二抗37℃孵育2 h，ECL显色试剂盒显色，使用DNR发光系统进行发光。
1.2.3 CCK-8实验 将细胞接种到96孔板中，每孔细胞密度为2000个细胞，每孔含100 μl的10%胎牛血清和10 μl的CCK-8试剂，培养箱中孵育2 h。酶标仪测定每孔细胞在450 nm处的吸收峰值，收集5 d数据。以细胞培养天数为横轴，以细胞相对生长率为纵轴制作生长曲线。
1.2.4 Transwell实验 将稀释后的细胞悬液加入24孔Transwell上室中，下室加入10%胎牛血清的DMEM培养基，于培养箱中培养16 h。PBS冲洗2次，将基质胶膜上层细胞用棉签轻轻擦掉，用多聚甲醛固定基底膜20 min，结晶紫染色5 min，自来水冲洗。倒置显微镜观察并计数迁移至膜下层的细胞数。每个样本随机选取5个视野，取其平均值。
1.2.5 Wound healing实验 在6孔板背后均匀划横线，横线间距为0.5 cm，每孔加5×105个细胞，培养箱中孵育，确保细胞达到100%融合。用枪头对照横线划痕，PBS冲洗，并加入无血清培养基继续培养。按照0、12、24 h时间点观察拍照。
1.3统计学分析 所有数据采用SPSS 17.0统计学软件进行统计，采用Student’s t检验方法，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1 TRIM32的表达情况 Western blot实验显示，TRIM32在MCF-10A正常乳腺上皮细胞中低表达，而在MCF-7乳腺癌细胞中高表达（P<0.05），见图1A;与空白对照组比较，MCF-7细胞中转染TRIM32质粒后TRIM32呈过表达（P<0.05），见图1B。
2.2过表达TRIM32对MCF-7乳腺癌细胞增殖能力的影响 CCK-8实验显示，与空白对照组比较，TRIM32过表达后MCF-7细胞增殖率提高（P<0.05），见图2。
2.3过表达TRIM32对MCF-7细胞浸润和侵袭的影响 Transwell实验显示，与空白对照组比较，过表达TRIM32后MCF-7乳腺癌细胞穿孔数目增加（P<0.05），见图3。Wound healing实验显示，与空白对照组比较，过表达TRIM32后MCF-7乳腺癌细胞12、24 h的迁移距离增加（P<0.05），见图4。
3讨论
TRIM32属于TRIM家族成员之一，最初认为其具有调节骨骼肌干细胞分化功能，在肌肉再生中起重要作用[6]。TRIM32包含6个NHL（NCL-1、HT2A和LIN-41）重复序列，调节蛋白质-蛋白质之间的相互作用。TRIM32是一种E3泛素连接酶，通过泛素化和降解P53，促进致癌基因转化和致癌过程[7]。最初发现TRIM32在小鼠的皮肤癌变模型中表达升高，随后在人类头颈鳞状细胞癌中也发现TRIM32过表达，提示TRIM32参与皮肤癌变过程[8，9]。文献报道，TRIM32在各种类型的癌中存在高表达，如在胃癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]和肝细胞癌[5]中高表达，其过表达与肿瘤预后差密切相关。
本研究通过转染TRIM32过表达质粒，调控MCF-7乳腺癌细胞中TRIM32的内源性过表达水平，分析过表达TRIM32对MCF-7乳腺癌细胞生物学功能的变化，结果发现TRIM32在MCF-10A正常乳腺上皮细胞中低表达，而在MCF-7乳腺癌细胞中高表达（P<0.05）。与空白对照组比较，MCF-7细胞中转染TRIM32质粒后TRIM32呈过表达（P<0.05）。细胞的增殖率是衡量肿瘤细胞恶性生物学行为的重要指标。CCK-8实验显示，与空白对照组比较，TRIM32过表达后MCF-7细胞增殖率提高（P<0.05），表明TRIM32过表达促进MCF-7细胞增殖能力，提示在乳腺癌发生中TRIM32可能为一种原癌基因，其表达上调后促进乳腺癌细胞的恶性增殖过程。细胞迁移、浸润和粘附是肿瘤预后差和转移的关键因素，是衡量肿瘤细胞恶性程度的重要指标[13]。Transwell实验显示，与空白对照组比较，过表达TRIM32后MCF-7乳腺癌细胞穿孔数目增加（P<0.05）;Wound healing实验显示，与空白对照组比较，过表达TRIM32后MCF-7乳腺癌细胞12、24 h的迁移距离较对照组增加（P<0.05）。提示TRIM32具有原癌基因功能，其表达上调后促进乳腺癌浸润、转移侵袭过程。 综上所述，TRIM32在乳腺癌细胞中高表达，过表达TRIM32促进乳腺癌细胞增殖、浸润和侵袭能力，其可能成为乳腺癌治疗的新靶点。
参考文献：
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收稿日期：2019-12-18;修回日期：2019-12-28
編辑/杜帆
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