姜黄素通过内质网应激信号通路诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用及对细胞活性影响分析

来源:用户上传      作者:李岩岩 陆淼炯

　　[摘要] 目的 分析姜黄素通过内质网应激信号通路诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用及对细胞活性影响。方法 选取2017年4月～2018年3月期间为研究时间段，以此期间购置的肝癌SMMC-7721细胞为试验样本，利用不同浓度姜黄素处理试验样本，先经流式细胞仪检测细胞凋亡情况，后经CCK8法分别在试验开始后24 h检测其细胞活力，再经流式细胞仪检测肝癌细胞ROS含量。 结果 姜黄素浓度越高，肝癌细胞存活率呈逐步下降趋势，同空白对照样本比较，有显著性差异（P<0.05）;姜黄素浓度越高，MFI值呈逐步升高趋势，同空白对照样本比较，有显著性差异（P<0.05）;不同浓度姜黄素处理的试验样本细胞凋亡率，呈逐渐上升趋势，与空白对照样本比较，有显著性差异（P<0.05）。 结论 利用姜黄素可有效地抑制肝癌细胞活性，诱导肝癌细胞凋亡。
　　[关键词] 姜黄素;内质网应激信号通路;肝癌SMMC-7721细胞;细胞凋亡;细胞活性
　　[中图分类号] R735.7          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）22-0041-04
　　Effect of curcumin on apoptosis of liver cancer SMMC-7721 cells induced by endoplasmic reticulum stress signaling pathway and its effect on cell viability
　　LI Yanyan   LU Miaojiong
　　Department of Anorectal Surgery， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou   310007， China
　　[Abstract] Objective To analyze the effect of curcumin on apoptosis of liver carcinoma cell line SMMC-7721 through endoplasmic reticulum stress signaling pathway and its effect on cell viability. Methods The period from April 2017 to March 2018 was selected as the study period. The liver cancer SMMC-7721 cells purchased during this period were used as test samples. The test samples were treated with different concentrations of curcumin， and the apoptosis of cells were first detected by flow cytometry. Then the cell viability was detected by CCK8 method 24 h after the start of the experiment. And the ROS content of liver cancer cells was detected by flow cytometry. Results The higher the concentration of curcumin， the lower the survival rate of liver cancer cells. Compared with that of the blank control samples， the data showed significant difference（P<0.05）. The higher the curcumin concentration， the higher the MFI value. Compared with that of the blank control samples， the data showed significant difference（P<0.05）. The apoptosis rate of the samples treated with different concentrations of curcumin showed a gradual increase trend， which was significantly different from that of the blank control group（P<0.05）. Conclusion Curcumin can effectively inhibit the activity of liver cancer cells and induce apoptosis of liver cancer cells.
　　[Key words] Curcumin; Endoplasmic reticulum stress signaling pathway; Liver cancer SMMC-7721 cells; Apoptosis; Cell viability
　　原發性肝癌在临床上并不少见，由于肝癌早期多无临床表现，或无特异性临床表现，故很容易被忽略，往往在体检中发现，而一旦出现临床表现，多已经发展至中晚期，严重威胁患者生命安全[1-2]。我国是全世界范围内肝癌发病的重灾区，多经手术治疗，但部分患者病情已经恶化，发展至晚期，或因其他原因导致，无法接受手术治疗，则可采取放疗、化疗及介入方式[3]进行治疗。但小肝癌治疗方案现仍存在一定的争议，而且肝癌治疗存在一定的个体化差异。目前，中医中药在肝癌治疗方面的作用现已逐步受到临床医务人员、患者及家属的重视。姜黄素多源自姜科中药根茎，色黄味苦，水溶性较差，但能溶于有机溶剂内。姜黄素多呈结晶粉末状，广泛用于食品添加及染色产业中[4]。实验发现姜黄素能够抗炎、抗氧化，而且在动脉粥样硬化性病变的防控中也能发挥较好的作用。上世纪末，国外学者首次提出利用姜黄素治疗癌症，随后几十年至今，发现姜黄素能够遏制多种癌症的生长及转移。由于肝癌发病早期诊断难度较大，且治疗性药物存在毒副作用及耐药性，故将姜黄素纳入肝癌的防控方案相关研究课题。本次研究以2017年4月～2018年3月期间购置的肝癌SMMC-7721细胞为试验样本，分析在不同姜黄素处理下的细胞活性及细胞凋亡情况差异。 　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　本次研究选取2017年4月～2018年3月期间为研究时间段，以在此期间购置的肝癌SMMC-7721细胞为试验样本，购自中科院上海生物科学研究院。
　　1.2 试剂与仪器
　　本次研究主要试验仪器及试剂：（1）RPMI 1640培养基，购自上海博升生物科技有限公司。（2）Gibco胎牛血清，购自上海江林生物科技有限公司。（3）elF2α，购自美国Sigma。（4）巴玖SAF-680T型酶标仪，购自上海巴玖实业有限公司。（5）贝克曼库尔特MoFlo XDP流式细胞仪，来自默瑞上海生物科技有限公司。（6）CCK 8法检测试剂盒，购自上海翊圣生物科技有限公司。（7）高速冷冻离心机，购自北京时代北利离心机有限公司。（8）超净试验台，购自深圳市金天地实验室设备有限公司。（9）姜黄素，购自美国Sigma。（10）DHP-9012恒温培养箱，来自上海一恒科学仪器有限公司。（11）PBS缓冲液，购自赛默飞世尔科技中國有限公司。（12）奥林巴斯CX 33显微镜，购自成贯仪器公司。
　　1.3 方法
　　1.3.1 细胞培养  将肝癌SMMC-7721细胞试验样本、Gibco胎牛血清（10%）、青霉素（浓度100 U/mL）及链霉素（100 U/mL）置于培养基内，送入恒温培养箱内，在环境温度37℃以及CO2（5%）条件下进行培养，当细胞≥80%时，达到后续试验使用标准。利用胰酶（0.25%质量分数）对贴壁细胞消化后，传代与冻存细胞比例为1∶3。
　　1.3.2 细胞凋亡检测  取肝癌SMMC-7721细胞试验样本（对数，且处于生长期内）接种在6孔板上，每孔接种细胞数量控制在106个;送入恒温培养箱内，在环境温度37℃以及CO2（5%）条件下进行培养，过夜后，分组如下：第一组为无姜黄素仅加细胞培养基及培养后肝癌细胞的空白对照样本，第二组在空白对照样本基础上加入姜黄素（浓度25 μmol/L），第三组在空白对照样本基础上加入姜黄素（浓度50.0 μmol/L）。PBS预冷后，洗涤收集好的细胞;加入Annexin V-FIT后，轻摇混匀，在室温避光条件下进行孵育，将时间控制在15 min;孵育后在1000 r/min条件下送入离心机内，离心5 min后，去除上清液，获取重悬细胞，再次加入预冷PBS缓冲液及PI染色剂后，轻摇，待混匀后，在环境温度4℃及避光条件下保存，利用流式细胞仪对上述混悬细胞液进行检测;本次试验重复3次后，取平均值。
　　1.3.3 肝细胞存活率检测  取肝癌SMMC-7721细胞试验样本（对数，且处于生长期内）接种在96孔板上，每孔接种细胞数量控制在5000个，分组试验，第一组为无姜黄素仅加细胞培养基及培养后肝癌细胞的空白对照样本，第二组在空白对照样本基础上加入姜黄素（浓度25.0 μmol/L），第三组在空白对照样本基础上加入姜黄素（浓度50.0 μmol/L）;每组平行孔5个;在环境温度37℃，以及5%的条件下进行培育，时间1 d。1 d后，注入CCK8溶液，用量10 μL，在37℃的环境温度下孵育，时间1 h;经酶标仪在波长450 nm条件下对吸光度进行检测，观察并记录A值;本次试验重复3次后，取平均值。
　　1.3.4 细胞ROS含量检测  取肝癌SMMC-7721细胞试验样本（对数，且处于生长期内）接种在6孔板上，每孔接种细胞数量控制在106个;送入恒温培养箱内，在环境温度37℃以及CO2（5%）条件下进行培养，过夜后，分组方案如下：分组试验，第一组为无姜黄素仅加细胞培养基及培养后肝癌细胞的空白对照样本，第二组在空白对照样本基础上加入姜黄素（浓度25 μmol/L），第三组在空白对照样本基础上加入姜黄素（浓度50.0 μmol/L）;在无血清培养基内加入DCFH-DA（浓度10.0 μmol/L）后，将收集的细胞加入其中，在37℃环境下进行孵育，时长20 min，经PBS漂洗2次后，利用流式细胞仪进行检测，分析荧光强度;其中，以MFI值表示ROS含量;本次试验重复3次后，取平均值。
　　1.4 观察指标
　　（1）不同浓度姜黄素条件下细胞凋亡试验结果分布，分析不同浓度姜黄素处理的试验样本细胞凋亡率差异。（2）不同浓度姜黄素条件下细胞活性检测结果分布，即检测不同浓度姜黄素条件下，肝癌细胞存活率以及MFI值。
　　1.5 统计学处理
　　数据采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，行t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 不同浓度姜黄素条件下肝癌细胞凋亡率比较
　　姜黄素浓度越高，肝癌细胞存活率越低，同空白对照组比较，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
　　2.2 不同浓度姜黄素条件下肝癌细胞存活率及MFI值比较
　　姜黄素浓度越高，肝癌细胞存活率呈逐步下降趋势，同空白对照样本比较，差异有统计学意义（P<0.05）;姜黄素浓度越高，MFI值呈逐步升高趋势，同空白对照样本比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。
　　3 讨论
　　3.1 肝癌的诊断及治疗
　　肝癌在我国发病率较高，这与国内乙肝群体数量较高有关[5-6]。肝癌恶化程度多较高，且病情发展速度较快，患者生存时间较短，治疗难度较大，严重威胁患者生命安全。到本世纪初，全世界范围内的肝癌患者超过一半在中国。肝癌在临床上的诊断及治疗方案诸多，但以病理作为诊断金标准[7-8]，而治疗方案除放化疗及手术治疗以外，还包括介入治疗、免疫治疗[9]及靶向治疗[10]等。手术治疗主要包括肝部分切除、肝移植等。而介入治疗是微创治疗方法的一种，现已证实该方案在抑制肿瘤生长、延长患者生存时间、提高其生存率方面，能够发挥良好的临床效果。介入方法主要包括两大类型，其一为血管介入方法，其二为非血管介入方法。血管介入方法以肝动脉化疗栓塞方法及肝动脉灌注化疗方案为代表性方案，适用于无法接受手术治疗的肝癌患者，或不能经手术切除的患者，比如小肝癌。而且，在肝动脉化疗栓塞方案中，化疗药物在肝组织局部缓慢释放，能够产生化疗的效果，适用于中晚期患者。非血管介入方法则以局部消融方案[11]为代表方案，即经皮穿刺后，将导管送至肝肿瘤，再利用物理及化学方法对瘤体进行破坏，比如无水乙醇注射，或局部热消融治疗方案，或125I放射粒子植入治疗[12]。 　　3.2 姜黄素
　　姜黄素属于一种色素，脂溶性较好，能够清除肝组织内的氧自由基，同时对肝组织内的炎性反应具有一定的抑制作用[13-14]。姜黄素主要产自姜黄，而莪术及郁金等其他药材内同样含有姜黄素。在传统中医理论中，姜黄功效主要包括温经行气、破血止痛。目前，姜黄素已经成为相关医学领域研究的重点课题。其中姜黄素的药理作用[15]主要包括：（1）抗肿瘤，抗肿瘤增生，提高机体对肿瘤细胞的敏感度，通过对肿瘤组织转录因子及生长因子等靶点的作用效果，发挥其抗肿瘤及杀灭肿瘤细胞的作用，或通过抑制MMP-2的表达，或肿瘤组织内VECF及bFGF的表达，发挥其降低肿瘤扩散的作用;诱导癌症细胞凋亡，比如激活Caspase-8/9/3[16]，提高ADP活性，诱导癌细胞凋亡，降低NF-等因子表达。（2）抗炎，减低巨噬细胞活性，促使蛋白激酶的激活，同时抑制促炎反应活性酶活性，適用于风湿性关节炎、急性肺损伤等疾病的治疗。（3）其他作用，比如抗氧化作用，抗病毒作用，保护神经及抗纤维化作用。
　　3.3 内质网应激反应
　　利用药物作用、氧化应激反应等多种因素，导致内质网产生应激反应，进而可致使内环境紊乱、内质网功能失调。而内质网应激反应的通路较多，而通过激发内质网应激反应，可诱导肿瘤细胞凋亡[17-18]。本次研究中，姜黄素浓度越高，肝癌细胞存活率呈逐步下降趋势，同空白对照样本比较，有显著性差异（P<0.05）;姜黄素浓度越高，MFI值呈逐步升高趋势，同空白对照样本比较，有显著性差异（P<0.05）;不同浓度姜黄素处理的试验样本细胞凋亡率，呈逐渐上升趋势，与空白对照样本比较，有显著性差异（P<0.05）。研究证实[19-20]，姜黄素浓度越高，肝癌细胞活性越差，肝癌细胞凋亡率越高，姜黄素可有成效抑制肝癌细胞活性，诱导肝癌细胞凋亡。但本次研究存在一定的局限性，比如研究时间较短，未与临床病理结合等，如有需要，可延长研究时间，或与临床病理结合进行研究。
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　　（收稿日期：2019-10-15）
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