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酶联免疫吸附试验影响因素探讨

来源:用户上传      作者: 孔莉娜 李北 李燕红

  【摘要】 ELISA法具有灵敏高、特异性强、重复性好的特点。被广泛用于临床上多种疾病的检查、诊断,但在标本的采集、试剂的质量、操作的程序、结果的判断等方面受人为的因素影响较多,为了确保ELISA的准确度和精密度,保证临床安全用血,笔者就实际工作中常见的试验影响因素进行了总结探讨。
  
  1 标本的采集
  1.1 防止污染 血液标本的采集做到一人一针一管,吸样时,必需使用一次性移液嘴,以防污染。
  1.2 及时测定 血样采集后应及时检测,久置后细胞代谢,细菌繁殖,增加了许多异性物质,易产生溶血。如不能及时测定,应将标本血清分离后放置在4℃冰箱中保存,但不超过3 d。
  1.3 避免稀释 标本在留取时,不能采用被保养液(抗凝剂)稀释后的抗凝血进行测定,否则被检测物的浓度降低,结果出现假阴性。
  2 试剂的影响
  2.1 目前卫生部国家药品生物制品研究所对国内应用甚广的ELISA试剂,按照国家标准实行“批批检”,凡合格者,贴上国家防伪标签才能使用。如HBsAg、抗,HCV、抗,HIV抗体等。
  2.2 不同批号、不同厂家的试剂,由于酶标记物中酶的浓度不尽相同,与固相载体上的相应抗原或抗体发生特异性反应的程度不同,故不能混合使用。对于超过有效期的试剂则严禁使用。
  2.3 试剂的运输、贮存要在低温(2~8℃)条件下进行。因酶类物质是一种特殊的蛋白质,久置、反复冻融或受热后,酶易失去活性,合格试纸条如果一次用不完时,应进行密封保存防止受潮。
  3 操作的要求
  3.1 不同厂家生产的试剂其样品加入量、水浴时间、阴阳对照等各不相同,应严格按照说明书中要求进行,吸样要准确,试剂加入的顺序不能颠倒,每一步加样后均需在振荡器上充分混匀。
  3.2 洗涤的效果直接影响实验结果的准确性。每次洗板之前要配制新鲜的洗涤液,室温较低时,洗涤液要在水浴箱中先预温30 min。用洗板机进行洗板时,每次都要吸净孔内洗液且不能留有气泡,倾去洗液时,必需用吸水纸吸尽洗液。
  3.3 阴、阳性对照对测定结果的准确性至关重要,每次试验都要按试剂盒说明书做阴性对照和阳性对照,要严格注意试剂盒说明书中规定的阴、阳性对照A值的界限。
  4 结果判断
  4.1 认真做好室内和室间质控。根据阳性对照计算值和阴性对照计算值来判断测试结果是否有效,每次测试结果必需在酶标仪上打印出来且记录完整,便于前后对照和查找。
  4.2 临界值结果OD值上、下10%~15%的区域为灰区,报告时要慎重,因为ELISA法的影响因素较多,±15%内的差异视为正常。遇此情况,可重复测试或进一步做确证试验,以确保结果正确,减少临床用血中的纠纷。
  4.3 结果判读读取结果要在15~30 min内完成,酶标仪不应置于阳光或强光照射下,需先预热15~30 min再进行测试。作为记录测定结果的仪器,酶标仪的性能稳定与否,决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养,对滤光片要定期校正;其次酶标仪波长设置要正确,最好使用双波长,一个检测波长,一个参比波长,以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外,在用酶标仪读数时最好先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同,使用中应详细阅读说明书。
  5 讨论
  综上所述,可见酶联免疫吸附试验的影响因素对于血液检测的准确度和精密度是至关重要的,血液检测质量是临床用血安全的保证,只有积极地采取相应措施进行消除才能保证实验的有效性,才能得到更准确更可靠的实验结果,使患者输上安全放心的血液。


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