禽白血病的检测与诊断

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　　禽白血病（AvianLeucosis）是由禽白血病病毒（AvianLeukosisVirus，ALV）和禽肉瘤病毒（AvianSarcomaVirus，ASV）群中的病毒感染引的多种肿瘤性疾病的统称。该病毒能够引起许多种具有传染性的良性和恶性肿瘤。根据临床症状可分为淋巴细胞性白血病（LLV）、成髓细胞白血病（AMV）、成红细胞性白血病（AEV）、髓细胞样白血病、结缔组织肿瘤和骨硬化病等。大多数禽白血病引起的肿瘤与造血系统有关，少数损伤其他组织。
　　1.ALV的临床症状
　　ALV感染的鸡群产生的临床症状和病理变化多种多样的，从生长迟缓、产蛋率下降、免疫抑制等亚临床表现，直至典型的肿瘤发生和死亡。感染鸡的表现与毒株、感染年龄及鸡的遗传性等密切相关。在实际病例中内脏肿瘤、体表皮肤血管瘤或其它组织的肿瘤较少，更多的病例表现为生产性能下降和免疫抑制导致的免疫失败。实际上，这种亚临床作用带来的经济损失可能大于病例的肿瘤性死亡带来的损失。
　　具有典型症状的发病鸡被剖检后，可见其内脏器官肝、脾、肾等有不同程度的肿大现象，且器官表面常出现灰白色的肿瘤结节。通过病理学观察，其他组织，如肺脏、心肌间质、卵巢基质等部位常常会弥散分布有肿瘤细胞，腺胃壁及法氏囊间隙偶尔会伴有髓样细胞瘤的出现。患病严重者，其组织便会缩小或消失。
　　2.ALV的检测与诊断
　　通过临床症状和剖检变化对ALV感染的进行初步诊断，对疑似病例可以通过肿瘤的鉴定和组织病理学检查初步诊断，然而马立克氏病和淋巴细胞白血病这两种最常见的淋巴肿瘤性疾病很容易混淆，并且大部分感染鸡仅有部分亚临床症状，此外，REV有时也会导致鸡产生淋巴细胞性肿瘤，使ALV的鉴别诊断更加困难。因此，需要通过病毒的分离鉴定、血清学检测方法和分子生物学检测等方法进一步确诊。
　　（1）病毒的分离鉴定
　　禽白血病毒既可以在鸡胚成纤维细胞上培养，也可以在DF-1细胞上培养。用DF-1细胞时只有外源性ALV生长，而用CEF细胞可能有内源性ALV的假阳性，鉴定需用群特异性抗体做IFA或通过测序划分亚群。病毒分离鉴定的优点是特异性高，可分离和保存流行株以进一步做致病性试验。其缺点是技术要求高，成本高，周期长。
　　（2）血清学检验
　　①简介免疫荧光（IFA）
　　该方法用于确定鸡或鸡群是否被外源性ALV-A/B或ALV-J感染过，其优点是方法简单、可大批量检测，通常代表外源病毒感染;缺点是与当前感染状态无直接关系，不能用于鉴别诊断。该方法主要用于流行病学调查或种鸡群净化状态的判断依据之一，常用于判定SPF鸡群有无感染。
　　②酶联免疫吸附试验（ELISA）
　　通过ELISA方法检测鸡群中ALV-J的抗原或抗体阳性率在生产上已成为主要的方法。用单克隆抗体建立的夹心ELISA具有很高的特异性。这种方法尤其适用于大批量样品的检测。用原核细胞高效表达的ALV-JJL-2株gp85基因产物为抗原建立了检测抗体的间接ELISA方法，具有较高的特异性和敏感性，重复性和稳定性好。但由于不同地区ALV-J流行株gp85基因及其分子变异存在着不同的规律，因此该方法可能只适用于检测地方流行株。如果gs抗原（P27）ELISA检测呈阳性，则需进一步用ALV-J亚群抗血清作中和试验，确定其是否为ALV-J亚群病毒，防止检出的是样品中的内源性病毒的gs抗原。如果是基于P27抗原的检测，则最好多次随机取样进行检测后才能鉴定，因為鸡群被外源性病毒感染后，在一定时期内P27的阳性结果将急速上升，而存在内源性病毒的鸡群P27阳性率相对保持稳定（通常维持在一个很低的百分点）。
　　ELISA操作简便，特异性强，重复性好，耗时较短，作为一种有效的普查方法在临床实际中应用较为广泛，常用于定期对种禽群进行ALV检测和净化。但因为常能同时检测出内源性的ALV，检测结果中常有假阳性的出现。
　　{3}病毒中和试验（NT）
　　一个亚群中的ALV只能被同亚群中的ALV抗体所中和，而不被其他亚群的特异性抗体所中和，因此用J亚群特异性抗体或抗血清可以鉴定ALV-J。利用ALV-J病毒中和试验检测鸡群，可以在感染鸡的血清中检测到ALV-J的抗体。然而，NT试验操作繁琐，耗时费料，临床诊断时很少应用，且该方法不易于规范化和制度化，故也不适合于进口鸡群的检测。
　　 {4}琼指扩散实验（AGP）
　　20世纪80年代，哈尔滨兽医研究所研究出用羽髓检测ALV的琼脂扩散实验，适用于现场大面积应用，曾在中国的种鸡净化中发挥了巨大作用。但是琼扩试验的敏感性较差，并有一定的假阳性出现。
　　（3）核酸分子检测方法
　　①PCR及RT-PCR
　　PCR可检测出ALV-J前病毒DNA，包括来自血液、肿瘤组织、病毒感染的组织或细胞培养物的样本。PCR方法的敏感性比ELISA方法高出5倍。PCR方法可以检测出ELISA抗体阴性鸡体内ALV-J，可能原因是鸡体内缺乏可以用ELISA方法检出的相应抗体。但PCR方法受到ALV-J的env基因序列和正常鸡群中同源基因的干扰，另外还受到抗原变异性的困扰，这使得PCR的使用变得越来越复杂。由于ALV-J的多变性，至今还没有找到一对引物可通过PCR检出所有J亚群病毒通过RT-PCR可以检测ALV病毒RNA。
　　②实时定量PCR
　　Kim等利用实时荧光探针RT-PCR对J亚群病毒RNA定量化，同时将其结果与（Qc）-RT-PCR、传统定量法（TCID50）和抗原捕获ELISA法进行了比较，发现实时荧光定量RT-PCR法特异性非常强，易于操作，重复性好。
　　③环介导等温扩增技术
　　Zhang等以普通水浴锅和3对特异性LAMP引物建立了一种ALV-J的LAMP检测技术，其敏感性比普通PCR高10倍，阳性率要比PCR高。因其可以在1h左右完成试验过程，所以具有快速的特点，同时操作简便，无需昂贵设备，因此适用于临床快速诊断。
　　（作者单位：561000贵州省安顺市西秀区农业农村局动物疫病预防控制中心）
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