蜚蠊目RNA干扰的应用研究进展及展望

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　　摘 要蜚蠊目昆虫的一些成员是世界公认的害虫，严重影响人类生活健康，采用RNA干扰（RNAi）技术可以减少蜚蠊目昆虫的数量以及疾病的传播。RNA干扰是外源性或内源性双链RNA经过Dicer酶加工处理为小干扰RNA（siRNA）与标靶基因结合，使相应标靶基因沉默的现象，从而阻止某一基因功能在细胞或整体水平上的表达，具有高效性和特异性等优势。RNAi技术作为研究基因功能的研究工具被广泛运用，并显示出开发新型有害生物管理策略的巨大潜力。近年来，此技术已被广泛成功应用于多种昆虫中，目前为止，只有较少文献关于蜚蠊目昆虫RNAi的报道。本文综述了RNAi在蜚蠊目中的应用研究进展，并展望了今后的研究方向。
　　关键词蜚蠊目;基因;RNA干扰;双链RNA;研究进展
　　0 前言
　　蜚蠊俗称蟑螂，属于昆虫纲（Insecta）、蜚蠊目（Blattaria），其中一些种类在医学与经济方面有巨大的危害性，它是世界性卫生害虫，包括美洲大蠊（Periplaneta americana）、澳洲大蠊（Periplaneta australasiae）、东方蟑螂（Blatta orientalis）、德国小蠊（Blattaria germanica），能够机械性传播多种致病菌，如痢疾杆菌、沙门杆菌、变形杆菌和寄生虫卵等病原体，是人类诸多疾病的传播媒介;其排泄物和蜕落的表皮可能会带有过敏原，从而引起过敏性疾病的发生[1]。
　　1 RNAi抑制蜚蠊产卵及疾病的传播
　　作为世界公认的卫生性害虫之一的蜚蠊[1]，严重影响人类生活和健康。蜚蠊类害虫具有惊人的繁殖速度，導致其种群数量庞大，而且粪便中携带七种过敏原[8]，直接暴露与人类的接触，增加人类发病率。因此，利用RNAi是一种有效控制蜚蠊数量及疾病传播的方法。有实验研究表明，蜚蠊粪便中含有过敏原且是蜚蠊体内的Blag 1蛋白起作用[8]，通过注射dsRNA抑制蜚蠊体内Blag 1 mRNA的表达，使蜚蠊消化能力下降，排便较少。经检测，注射dsRNA的蜚蠊Blag 1 蛋白的含量远远低于对照组的Blag 1 蛋白的含量，且在第6天后，未注射的蜚蠊Blag 1 蛋白的含量将近注射dsRNA的蜚蠊的9倍[8]，注射dsRNA减少了过敏原的排出，从而降低了与人类接触的几率，从而降低人类发病率。注射dsRNA还会影响蜚蠊体内保幼激素的合成量，从而影响蜚蠊的正常发育，而且还会影响卵黄细胞的成熟。注射dsOKs（Double-stranded Orcokinins）会降低OK（Orcokinin）基因mRNA的表达，影响卵母细胞的生长[9]，降低了雌性蜚蠊受精成功率，从而减少蜚蠊的出生率。总的来说，利用RNAi技术能够有效控制蜚蠊种群数量和疾病的传播，特别是过敏原的传播。
　　2 dsRNA导入蜚蠊体内的方法
　　目前，对昆虫的然RNAi技术的研究已比较成熟，将dsRNA导入昆虫体内普遍使用的方法有注射法和喂食法两种。
　　注射法：将体外合成的dsRNA通过微量注射器注射到昆虫体内，是目前应用最普遍的导入方法。Kennerdell和Carthew用显微注射的方法将dsRNA注入果蝇胚胎中，实现了用RNAi技术对昆虫基因功能的研究。继 RNAi技术在果蝇的成功应用之后，通过人工介导的方式引入dsRNA昆虫体内，产生缺陷型个体来研究基因的功能已被越来越多的昆虫学家应用[5]。采用RNAi技术注射dsRNA，抑制蜚蠊目昆虫相应标靶基因的表达。利用注射的方式向蜚蠊目昆虫体内导入dsRNA，注射位置通常在第三腹节和第四腹节之间[8]，据其他文献报道，小蠊的头部和胸部也可以注射，但只有腹部注射效果最好[9]，原因是注射头部，头部神经比较多，容易造成死亡，成功率不高，注射胸部，肌肉过多，不易注射。注射需控制注射量，加入注射量过少，干扰效果不明显，随着注射量的增加一定量之前，干扰效果会更加明显[8]，但超过一定量后，会致死小蠊。但是RNAi产生显著干扰效果持续时间不长，在一段时间后抑制效果会减弱甚至消失一般在6天或12天[10]。由于德国小蠊血液中含有的少量能够降解dsRNA的物质[10]，因此，为了注射的dsRNA作用效果更好，采用脂质体将其包裹，注射进入血液循环，更加容易与标靶细胞结合。由于注射法的适用范围较为限制，只能在实验室使用，从而可以采用另一种适用范围较广的方法-喂食法。
　　喂食法：根据昆虫都具有取食的行为特点，科学家使用喂食dsRNA将其导入昆虫体内。喂食dsRNA操作简单方便，容易实现，且对昆虫损失小[6]，因此在大多数情况下，可能是运用范围较广且比较普遍适用的一种dsRNA导入方法。通过将dsRNA从小蠊口器中进入食道，小肠上皮细胞吸收dsRNA进入细胞。对昆虫的相关研究表明，dsRNA的摄取与网格蛋白依赖性内吞作用和巨胞吞作用有关[3]。细胞摄取 dsRNA的机制为系统性RNA干扰缺陷型2（systemic RNA interference defective 2，Sid2）的肠腔内跨膜蛋白的被动转运，在其中它充当昆虫中摄入的 dsRNA的内吞受体，进入细胞后，细胞通过网格蛋白依赖性和其他内吞途径摄取的 dsRNA通过内体转运到这些细胞质位点，将喂食的dsRNA转化为 siRNA[3]，让siRNA与标靶基因接触，使相应的mRNA沉默。但是由于小蠊中肠中存在能够分解dsRNA的液体[10]（以下简称中肠液），对刚进入食道内的dsRNA及食物一道进行分解，很难让其进入细胞发挥作用，因此采用一种能够抗中肠液分解物质-脂质体将其包裹，其进入食道，避免被分解，从小肠上皮细胞进入，从而发挥作用，使mRNA沉默[10]。喂食裸露的和有脂质体包裹的dsRNA，经定量PCR检测，喂食脂质体包裹的dsRNA有比较高的表达，而喂食裸露的dsRNA几乎完全被降解[10]。
　　3 结语和展望 　　随着科学技术的不断发展，RNAi技术已不再普遍适用，给昆虫学家提出了新的技术挑战。外源性RNA片段体内转染效率低下，dsRNA在昆虫体内不稳定，发挥作用时间短、易降解，目前还没有找到一种能够有效将dsRNA投入自然中來控制蜚蠊的数目及其他功能。在这个方向上，仍需要努力探索，早日找出适用且经济的方法来控制蜚蠊种群数量。
　　参考文献
　　[1]牛东娟.德国小蠊化学感受相关基因的鉴定与组织表达谱分析[D].南京农业大学，2016.
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　　[3]Sheila O， Xavier B， L M J. Orcokinins contribute to the regulation of vitellogenin transcription in the cockroach Blattella germanica.[J]. Journal of insect physiology. 2015， 82.
　　[4]杨中侠，文礼章，吴青君，等. RNAi技术在昆虫功能基因研究中的应用进展[J]. 昆虫学报. 2008（10）： 1077-1082.
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　　[6]王聪，蔡普默，张琪文，等. RNAi技术在农业害虫防治中的应用研究进展[J]. 中国植保导刊. 2018， 38（06）： 22-29.
　　[7]Zhu K Y， Palli S R. Mechanisms， Applications， and Challenges of Insect RNA Interference[J]. Annual review of entomology. 2020， 65（1）： 293-311.
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