甘蓝型油菜单倍体遗传转化优化试验

来源:用户上传      作者: 申敏 殷家明

　　摘 要：以甘蓝型油菜单倍体试管苗或花粉胚状体作为试验材料进行遗传转化。结果表明，花粉胚状体在液体培养基加入2，4-D 1.0 mg·L-1 预培养6 d，得到的绿色愈伤率最高；甘蓝型油菜花粉植株PCK121茎段在预培养基（6-BA 0.5 mg·L-1 +2,4-D 2.0 mg·L-1）上预培养后得到的绿色抗性愈伤率最高；油菜单倍体试管苗叶柄和茎段在预培养时间0～10 d后转化均可产生抗性愈伤；在培养基中添加2，4-D时，很容易产生绿色抗性愈伤，这是因为此时培养物对卡那霉素的耐受性增加。
　　关键词：甘蓝型油菜；遗传转化；单倍体
　　中图分类号：S565.4 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.03.003
　　Preliminary Study on Genetic Transformation of Brassica napus Haploid
　　SHEN Min，YIN Jia-ming
　　（College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China）
　　Ａｂｓｔｒａｃｔ: Brassica napus haploid test-tube plantlets or pollen embryoids were used as materials for transformation. The results showed that pollen embryoids precultured in liquid medium by adding 2,4-D 1.0 mg·L-1 for six days had the highest green callus percentage. The stem of the pollen-derived plantlets PCK121 got a maximum green callus percentage in meduim with 6-BA 0.5mg·L-1+2，4-D 2.0 mg·L-1. The leave petiole and shoot-stem transformed after 0~10 days preculture could produce resistent callus. Resistent callus could be easily obtained when the acceptor were cultured in medium with 2,4-D, which suggested that the cultures had increasing resistence to kanamycine.
　　Key words: Brassica napus; genetic transformation; haploid
　　研究表明，黄籽频率高的油菜品种含油量高，饼粕中蛋白含量高。TT基因，即透明种皮（Transparent testa）基因，为类黄酮代谢途径功能基因，与拟南芥黄籽性状形成有关，与油菜黄籽等性状的形成也有关，在甘蓝型油菜高含油量、高蛋白含量黄籽育种中受到高度重视[1]。重庆市油菜工程技术研究中心根据拟南芥TT8基因序列同源克隆了甘蓝型油菜TT8基因，并已构建了反义植物表达载体。
　　目前，虽然已获得了许多转基因油菜植株，但大多用子叶柄和下胚轴等二倍体组织细胞作为遗传转化的受体[2]，单倍体遗传转化研究报道很少[3]。二倍体组织细胞遗传转化都是经过了大量的重复实验后仅得到为数不多的转化体克隆，转化效率较低,且二倍体自然纯合需要时间较长。而对单倍体转化植株进行加倍，只需1代即可得到纯合体[4]。再者以单倍体作为转化受体可望提高转化效率，这是因为单倍体只有1个染色体组利于外源基因的整合[5]；另一方面是因为单倍体细胞及其衍生组织具有容易再生植株的能力[6]；再一方面是因为单倍体无同源染色体的影响。总而言之，单倍体遗传转化可以简便、快速纯合外源基因，在育种工作上，可大大缩短育种年限。
　　本试验试以甘蓝型油菜单倍体作为转化受体，采用农杆菌介导法导入TT8反义基因。笔者对影响油菜单倍体转化的预培养时间[7]、培养方式、基因型受体材料、受体材料部位、培养基激素配比进行了初步试验，以期为建立以油菜单倍体胚状体或试管苗外植体为转化受体的高效转化体系提供参考。
　　1 材料和方法
　　1.1 材 料
　　试验材料包括甘蓝型油菜通过小孢子培养得到的单倍体无菌试管苗和花粉胚状体。具体编号如下。
　　重庆市油菜工程研究技术中心保存的不同基因型甘蓝型油菜单倍体无菌试管苗材料：07pc5-1、07pc5-4、07pc7-10、07pc7-18、07pc7-202、06pc76-12、06pcR22-4、07oc-1-2、08PCK70r、
　　08PCK113X、08PCK121、08PCY136-29、Y136-2、
　　PC659-1ed-3、No.4。
　　花粉胚状体：08PCK121。
　　农杆菌工程菌株PFT8HS，其Ti质粒上携带有P35s 驱动的甘蓝型油菜TT8基因反义片段、GUS报告基因和NPTII卡那霉素抗性基因。
　　1.2 方 法
　　1.2.1 转化程序
　　（1） 预培养。将供体材料外植体切为2 mm左右的小切段或者2 mm×2 mm小块接种在预培养基上，接种后在人工气候室中培养（25 ℃左右，7 000 lx、16 h光照）。
　　（2）农杆菌活化。取PFT8HS的平板用接种针挑取1个单菌落放入液体的LB（链霉素 20 mg·mL-1、卡那霉素40 mg·mL-1 、利夫平25 mg·mL-1）摇匀，在28 ℃摇床上培养16 h，取75 uL农杆菌加入液体的LB（链霉素20 mg·mL-1、卡那霉素40 mg·mL-1、利夫平25 mg·mL-1）摇匀，在28 ℃摇床上培养18 h使其生长到对数期（OD600≥0.5）。

　　（3）侵染与共培养。用MS将活化后的农杆菌（1 000 rpm，5 min）重悬，加入100 mmolAS，在28 ℃摇床上培养6 h。将预培养的外植体取出用MS+AS+农杆菌侵染（69 r·min-1，12 min）后，用固体培养基或液体培养基培养。放入24.5 ℃生化培养箱暗培养48 h。
　　（4）筛选分化培养。取出共培养基中的外植体，用MS清洗，再用MS+蔗糖+羧苄青霉素300 mg浸泡30 min（杀死多余的农杆菌），用无菌滤纸吸干，再接种到筛选分化培养上。培养一段时间后观察统计抗性愈伤率或进行GUS表达的组织化学检测。
　　1.2.2 GUS染色 用刀片将侵染过的外植体切成大约0.5 mm大小，将切片浸泡在现配制的X-gluc[8]染色液中，放在37 ℃的水浴过夜，注意避免溶液的蒸发，再用磷酸缓冲液或水冲洗切片，用梯度酒精对叶片进行褪色处理，绿色退掉后观察，白色背景上的蓝点或蓝斑为GUS表达位点。
　　1.2.3 预培养时间和培养基以及培养方式对花粉胚状体转化的影响 将花粉胚状体（PCK121）切为约2 mm×2 mm的小块接种在预培养基上培养一段时间后侵染和共培养，共培养48 h后杀菌转入筛选分化培养基。
　　试验使用了4种预培养基，包括2种固体培养基和2种相应的液体培养基，分别是：（1）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 7 g·L-1；
　　（2）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 0.2 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 7 g·L-1；
　　（3）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1；
　　（4）MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 0.2 mg·L-1 +蔗糖 30 g·L-1。
　　预培养时间有3个设置：2，4，6 d。
　　共培养基有2种：MS+NAA0.1 mg·L-1+BA 1.0 mg·L-1+GA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂 7 g·L-1 ; MS+NAA0.1 mg·L-1+BA 1.0 mg·L-1+GA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1;筛选分化培养基：MS+NAA0.1 mg·L-1+BA 1.0 mg·L-1 +GA3 0.1 mg·L-1； +蔗糖30 g·L-1+AgNO3 5 mg·L-1+Kan 15 mg·L-1+Carb300 mg·L-1+琼脂7 g·L-1。
　　1.2.4 单倍体试管苗转化受体基因型和外植体的初步筛选 取在MS培养基上保存培养的07pc5-1、07pc5-4、07pc7-10、07pc7-18、07pc7-202、06pc76-12、06pcR22-4、07oc-1-2 、PCK121 、Y136-2、PC659-1ed-3、07PC7-202等材料，将其叶柄和茎段切成2 mm左右切段预培养5~6 d，浸染和共培养后转移到筛选分化培养基上。
　　预培养基 ：MS+2，4-D 1.0 mg·L-1+BA 0.5 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+琼脂 7 g·L-1。
　　共培养基：MS+NAA 0.5 mg·L-1+BA3.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1（pH值5.8）。
　　筛选分化培养基： MS+NAA0.5 mg·L-1+BA3.0 mg·L-1+GA30.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+Kan15 mg·L-1+AgNO3 5 mg·L-1+Carb 300 mg·L-1+琼脂 7 g·L-1 ( pH值5.8)。
　　1.2.5 预培养时间对单倍体试管苗转化的影响 取在MS培养基上保存培养的No.4号基因型单倍体试管苗，将叶柄切为大约2 mm切段用于转化。
　　预培养基：MS+6-BA 0.5 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1（pH值5.8)。
　　预培养时间采用6个时间处理：0，2，4，6，8，
　　10 d。
　　共培养基：MS+NAA 0.5 mg·L-1+BA3.0 mg·L-1 +蔗糖30 g·L-1（pH值5.8）。
　　筛选分化培养基：MS+NAA0.5 mg·L-1+BA3.0 mg·L-1+GA30.6 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+Kan15 mg·L-1+AgNO3 5 mg·L-1+Carb 300 mg·L-1+琼脂 7 g·L-1 (pH值5.8)
　　1.2.6 受体外植体部位和培养基激素对单倍体试管苗转化的影响 取在MS培养基上保存培养的No.4、No.2和PC659-1ed-3试管苗，将茎段（st）和叶柄(p)切成较小的切段用于转化。
　　预培养基、共培养基和筛选培养基包括2类，一类是含有2,4-D 0.2 mg·L-1的，另一类是含有NAA0.5 mg·L-1的。
　　预培养基I：MS+BA 2.0 mg·L-1 +2,4-D 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1。
　　预培养基II：MS+BA 2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1。
　　共培养基I：MS+BA 2.0 mg·L-1 +2,4-D 0.2 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1。
　　共培养基II：MS+BA 2.0 mg·L-1 +NAA0.5 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1。
　　筛选培养基I：MS+BA 2.0 mg·L-1 +2,4-D 0.2 mg·L-1+GA3 0.6 mg·L-1 +Kan15 mg·L-1+AgNO3 5 mg·L-1+Carb 300 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1。

　　筛选培养基II ：MS+BA 2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+GA30.6 mg·L-1 +Kan15 mg·L-1+AgNO3 5 mg·L-1+Carb 300 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂7 g·L-1。
　　预培养、共培养和筛选培养均在相应的培养基上进行，即分别在I类培养基上预培养、共培养和筛选培养与在II类培养基上预培养、共培养和筛选培养。
　　2 结果与分析
　　2.1 预培养时间和培养基以及培养方式对花粉胚状体转化的影响
　　试验共8个处理，即：4.10-3-4.19（液体3号培养基培养6 d）、4.10-4-4.19（液体4号培养基培养6 d，在培养过程中因污染失去）、4.14-3-4.19（液体3号培养基培养2 d）、4.14-4-4.19（液体4号培养基培养2 d）、4.12-1-4.19（固体1号培养基培养4 d）、4.12-2-4.19 （固体2号培养基培养4 d）、4.14-1-4.19 （固体1号培养基培养2 d）和4.14-2-4.19（固体2号培养基培养2 d）。
　　筛选培养20 d后对愈伤生长进行观察，结果如表1所示。
　　由表1可知，各个处理下均有一定的抗性绿色愈伤，绿色愈伤率最高的处理是4.10-3-4.19，即液体培养基加入2，4-D 1.0 mg·L-1 预培养6 d。
　　同时，对处理4.10-3-4.19的绿色愈伤进行组织化学检测，一共检测了58块绿色愈伤组织，着色的42块，其中3块有蓝斑（蓝斑共有8个），其它呈侵润状蓝色。这说明外源基因已进入到受体细胞并有表达。
　　继续筛选培养20 d后，对其它处理的愈伤进行检测，结果都没有出现GUS表达，说明随着时间的延长外源基因导入但没有被整合就被降解，先前的表达为瞬时表达。
　　2.2 单倍体试管苗转化受体基因型和外植体的初步筛选
　　以材料07 pc7-202、07pc5-4、06pR22-4、06pK76-12、07pc7-18、07pc7-10、07OC-1-2、07pc5-1等进行试验，筛选培养一段时间后观察，各材料的茎段和叶柄都比较新鲜，其中07 pc7-202 st、07 pc7-202 p还获得了抗性芽。
　　分别对PCK121 、Y136-2、PC659-1ed-3和07PC7-202转化筛选，培养2个月后观察，结果见表2。
　　据表2可知，各个基因型材料的叶柄和茎段外植体在转化筛选培养后都可得到或多或少的绿色抗性愈伤，以PCK121(st)在转化筛选后得到的绿色愈伤率最多，其余材料得到的绿色愈伤率差别不大。
　　2.3 预培养时间对单倍体试管苗转化的影响
　　共设计6种处理，对No.4号单倍体试管苗叶柄切段经过不同时间的预培养，然后浸染转化，经过2个月的筛选培养得到的绿色愈伤率见表3。
　　据表3可知，有无预培养均可得到一定数量的抗性绿色愈伤，以预培养6 d得到的绿色愈伤频率最高，预培养6 d和8 d得到的差别不大。
　　2.4 基因型、受体外植体部位和培养基激素对单倍体试管苗转化的影响
　　将No.4、No.2、PC659-1ed-3试管苗茎段和叶柄切成较小的切段用于转化。筛选培养后观察统计，各处理的抗性愈伤率见表4。
　　从表4可以明显看出，在培养基含2，4-D时抗性愈伤率远远高于不含2，4-D的处理。
　　对在不含2，4-D的培养基上培养的结果进行方差分析和多重比较，结果见表5、表6。
　　从表5和6可知，在培养基中不含有2，4-D时，基因型对抗性愈伤的获得有很大的影响，而外植体部位的影响显著。以659的叶柄和茎段转化得到的绿色愈伤率最高。
　　对加2，4-D的培养基条件下的结果进行方差分析和多重比较，其结果见表7、表8。
　　从表7和表8可以看出，在培养基中含有2，4-D时，基因型间和外植体部位间以及各个处理间抗性愈伤率的差异都不显著，各处理的抗性愈伤率均高达近乎100%。
　　3 讨 论
　　本试验以花粉胚状体和单倍体试管苗外植体为转化受体进行研究[9]，期望获得转基因植株的高效率转化体系。单倍体遗传转化可以简便、快速纯合外源基因，在育种工作上，可大大缩短育种年限[10]。TT基因为类黄酮代谢途径功能基因，与油菜黄籽等性状的形成有关。油菜TT基因反义转化单倍体，可望快速获得较多的纯合转基因株系，为油菜高油高蛋白黄籽育种研究提供材料和基础。
　　在研究花粉胚状体作为受体材料时，对预培养基和时间以及预培养和共培养方式进行设置，最终得出在液体预培养基6-BA 0.5 mg·L-1+2，4-D 1.0 mg·L-1预培养6 d的情况下，得到的绿色抗性愈伤最多。
　　对单倍体试管苗研究时，将花粉植株叶柄和茎段作为受体部位、选择较好的受体基因型的试验中，部分基因型的单倍体试管苗得到抗性芽，而基因型PCK121茎段在预培养后得到的绿色抗性愈伤最多，其余材料得到的绿色愈伤差别不大。进而对No.4号基因型的预培养时间进行试验，共设置了6个处理，经过观察，预培养6 d得到的绿色愈伤频率最高。预培养时间太长或太短效果都不好。最后再进行单倍体基因型、受体部位、预培养基和共培养基激素对抗性愈伤率的影响试验[11]，结果表明，在培养基中含有2，4-D抗性愈伤率远远高于不含2，4-D的，近乎100%。有2种可能的原因：一是在含有2，4-D时转化率确实较高；二是在含有2，4-D时，培养物对卡那霉素的耐受性增加，培养基中所施加的选择压不够。前人的研究表明，遗传转化的效率很低，因此后者更可能是真正的原因。
　　参考文献：
　　[1] Fladung M, Deutsch F, Honicka H, et al. T-DNA and transposon tagging in aspen[J]. Plant Biol (Stuttg), 2004, 6(1):5-11.

　　[2] Chen C, Xiao H, Zhang W, et al. Adapting rice anther culture to gene transformation and RNA interference[J]. Sci China C Life Sci, 2006, 49(5):414-428.
　　[3] Ishizaki K, Chiyoda S, Yamato K T, et al.Agrobacterium-mediated transformation of the haploid liverwort Marchantia polymorpha L., an emerging model for plant biology[J]. Plant Cell Physiol, 2008, 49(7):1084-1091.
　　[4] Tscharke R L, Lazera M, Chang Y C, et al. Haploid fruiting in Cryptococcus neoformans is not mating type alpha-specific[J].Fungal Genet Biol, 2003, 39(3):230-237.
　　[5] Chauhan H, Khurana P. Use of doubled haploid technology for development of stable drought tolerant bread wheat (Triticum aestivum L.) transgenics[J]. Plant Biotechnol J, 2011，9(3):408-417.
　　[6] Shim Y S, Pauls K P, Kasha K J. Transformation of isolated barley (Hordeum vulgare L.) microspores: II. Timing of pretreatment and temperatures relative to results of bombardment[J]. Genome, 2009, 52(2):175-190.
　　[7] Sparrow P A, Dale P J, Irwin J A.Brassica oleracea[J]. Methods Mol Biol，2006, 343:417-426.
　　[8] Rakosy-Tican E, Aurori C M, Dijkstra C, et al. The usefulness of the gfp reporter gene for monitoring Agrobacterium-mediated transformation of potato dihaploid and tetraploid genotypes[J]. Plant Cell Rep, 2007, 26(5):661-671.
　　[9] Tsuwamoto R, Yokoi S, Takahata Y. Arabidopsis EMBRYOMAKER encoding an AP2 domain transcription factor plays a key role in developmental change from vegetative to embryonic
　　phase[J]. Plant Mol Biol, 2010，73(4-5):481-492.
　　[10] Xu H, Davies S P, Kwan B Y, et al. Haploid and diploid expression of a Brassica campestris anther-specific gene promoter in Arabidopsis and tobacco[J]. Mol Gen Genet ,1993, 239(1-2):58-65.
　　[11] Chamandoosti F.Effect of sodium chloride on establishment of callus and organogenesis in Brassica napus L[J]. Pak J Biol Sci, 2007, 10(21):3880-3884.
　　收稿日期:2012-03-02;修订日期：2012-05-15
　　作者简介：申敏（1987-），女，山西长治人，在读硕士生，主要从事油菜转基因功能验证研究。

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