猪胃肠道微生物菌群的研究现状浅析
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作者: 柳尧波 凌泽春
摘要：动物胃肠道微生物菌群与宿主胃肠道环境和宿主所处的外界环境密切相关，形成统一的整体。本文对猪胃肠道微生物菌群的组成和分布、菌群的作用、影响菌群的因素以及菌群的研究手段和调控等进行了浅析，为猪胃肠道微生态区系的研究和调控提供参考。
关键词：猪；胃肠道微生物菌群
中国分类号：S828.1－1 文献标识号：A 文章编号：1001―4942(2011)10―0090―05
动物胃肠道正常微生物区系在动物营养、健康、防病、免疫等方面发挥着重要作用。从19世纪法国微生物学家巴斯德提出正常菌群对宿主是有益的学说以来，人们对畜禽胃肠道正常微生物群的组成、定殖规律及其与宿主关系有了越来越多的了解。畜禽胃肠道微生物在正常情况下，各种菌群处于稳定的平衡状态，保证其胃肠道正常的消化和吸收。同时，有益菌群定殖于胃肠道内壁黏膜，形成非特异性生物保护屏障，抑制病原菌在消化道壁的定殖，维持胃肠道正常的微生态平衡。当外界环境发生变化或饵料变更等应急状态时，这种理想的微生物区系平衡会受到冲击，消化道内的有害菌群增多，将会导致细菌性疾病的暴发。由此可见，动物胃肠道微生物区系的理论平衡是宿主动物保持良好的健康状况和发挥正常生产性能所必须的条件。因此，如何利用益生素、化学益生素等调控动物胃肠道微生物组成，保持动物胃肠道微生物区系平衡、维持动物健康成为国际上的研究热点。
1 猪胃肠道微生物的组成和分布
研究表明，动物出生前胃肠道中是无菌的，但是出生后3-4 h，肠道内开始检测出细菌。微生物菌群在消化道内的定殖顺序首先是需氧菌，然后是兼性厌氧菌，最后是专性厌氧菌。苏勇等(2006)研究结果显示，哺乳期仔猪胃中细菌数量较低，Pluske等(2003)认为，哺乳期仔猪胃和小肠中的优势菌群为乳酸杆菌和链球菌。断奶仔猪胃肠道微生物环境很不稳定，断奶应急和日粮成分的变化，使胃肠道内环境发生了改变，因而胃肠道中微生物的数量及定殖位点也会随着发生改变。有研究显示，无菌采集断奶仔猪(30日龄)胃、十二指肠、回肠、盲肠和直肠各肠段及内容物测定菌群数量，结果发现，胃、十二指肠、回肠、盲肠和直肠中双歧杆菌(Bifidobacterium)均为优势菌，胃中双歧杆菌最多，其次是乳酸杆菌。十二指肠中双歧杆菌最多，其次是肠杆菌(Enter-obacter)、乳酸杆菌(LactobaciIlus)。回肠中双歧杆菌最多，其次是肠球菌(Enterococcus)、小梭菌(Clostridium)、肠杆菌；盲肠中双歧杆菌最多，其次是小梭菌；直肠中双歧杆菌最多，其次是小梭菌、乳酸杆菌。而数量上，双歧杆菌在十二指肠中最多，乳酸杆菌在胃、直肠中最多，肠杆菌在回肠中最多，肠球菌在回肠、直肠中最多，小梭菌在盲肠中最多。
2 猪胃肠道微生物菌群的作用
2.1 营养作用
动物胃肠道菌群依赖动物体自身营养或分解动物胃肠道内食物而赖以生存，同时，菌群及其代谢过程产生的维生素及胞外酶产物可被动物机体吸收，在营养、消化和吸收方面具有重要作用。研究表明，非反刍动物以猪为例，胃肠道菌群在体内能合成B族维生素并为宿主所利用；单胃动物盲肠中菌群可以产生有机酸，为动物机体提供营养的同时，还间接提高了蛋白质和能量利用率，乳酸菌产生的乳酸能抑制植酸对肠道中钙和磷的络合，增加机体对钙和磷的吸收。
2.2 拮抗作用
定殖在猪胃肠道内的细菌可以抑制外源菌生长与定殖，对猪健康生长、预防病害有积极意义。专性厌氧菌在代谢过程产生挥发性脂肪酸和乳酸，降低胃肠道pH和氧化还原电势，从而抑制外源菌的生长和繁殖，同时大量酸使肠内容物变酸，促进肠蠕动，从而使外源菌未与胃肠道黏膜表面接触、粘附就被排出；另外占优势的肠道菌还通过与黏膜上皮细胞紧密结合，起到对宿主细胞占位性保护作用。此外微生物代谢产生一些抗菌的活性物质，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)能分泌具有广谱抗菌活性的类细菌素物质，对大肠杆菌(Escherichia coil)等革兰氏阴性菌具有抑制作用。
2.3 免疫作用
胃肠道菌群与宿主之间是相互影响、相互作用的复杂系统。宿主将这些细菌当作自身免疫的一部分，一般不引起或仅产生低水平的免疫反应。无菌动物的研究中，当肠道菌群缺乏时，往往造成肠道免疫系统发育不良，肠道的形态也受到破坏，免疫球蛋白水平处于较低水平。研究认为，动物胃肠道稳定的菌群结构能协助动物免受感染，特别是胃肠道感染。乳酸菌在胃肠道中定殖可以抵抗致病菌、增强抗感染能力的同时，还可以增加肠黏膜的免疫调节活性。
2.4 致病作用
动物胃肠道菌群正常条件下，处于动态平衡，维持动物胃肠道正常的生理功能，但当胃肠道内外环境变化时，胃肠道的平衡遭到破坏，使病原菌或条件致病菌异常增殖，导致动物疾病的发生。
3 影响动物胃肠道菌群的因素
3.1 生长阶段
仔猪胚胎处于无菌状态，出生3-4 h后肠道内可检测到大肠杆菌和链球菌。仔猪从出生到断奶后胃肠道菌群的组成一直在发生连续的变化，一般认为直到育肥期才趋于平衡。仔猪前两周内胃肠道微生物主要来源于母猪。断奶后仔猪，由于断奶应激降低了自身循环抗体水平并抑制细胞免疫力和免疫水平，使仔猪抗病力弱易感染病原微生物。另一方面，断奶后消化酶活力下降，消化和吸收能力下降，使未消化的营养物质被病原菌利用而大量增殖，从而使仔猪消化道微生物区系发生紊乱。研究发现，仔猪断奶后营养供应由母乳转向饲料，胃肠道微生物菌群结构由乳酸菌为主的多样性程度较低的简单区系到以厚壁菌门和拟杆菌门细菌为主的高度多样化的复杂区系的重建过程。
3.2 环境因素
外界环境如气温剧变会引起猪胃肠道菌群的数量变化。应激能破坏已建立的肠道保护性微生物群系。应急条件下，肠道微生物区系中乳酸菌减少，大肠杆菌数量增加，使肠腔积水，上皮细胞破坏，甚至导致腹泻。
3.3 日粮
日粮发生变化时，动物胃肠道菌群也出现相应改变。日粮中的营养成分可以选择性地刺激特定细菌生长。改变日粮中纤维数量可以调控胃肠道微生物群落结构。高纤维日粮显著增加动物胃肠道中纤维分解菌数目。日粮类型对猪胃肠道微生物区系也有影响。饲喂液态饲料与饲喂干态日粮相比，猪胃肠道内容物大肠杆菌显著降低，乳酸杆菌升高，但差异不显著。可能因为液体饲料发酵过程中产生大量乳酸，使胃肠道pH值低于5.8，从而明显抑制了大肠杆菌的生长，使乳酸杆菌与大肠杆菌的比值幅度增大。另外，许多非营养添加剂，如抗生素、益生素和中草药等，都会影响胃肠道微生物区系。
3.4 猪的生理状态
动物处于不同生理状态，其胃肠道菌群数量和种类也呈现不同的结构特征。研究发现，健康仔猪粪便中存在大肠杆菌但不表现为优势菌，而
腹泻仔猪粪便中，大肠杆菌为优势菌，显示仔猪腹泻与大肠杆菌的过度繁殖成为肠道优势菌有很大关系。
4 胃肠道菌群的研究手段
生态系统是由宿主、微生物和环境之间相互作用构成的统一整体，由各个层次、环节相互结成的立体交叉网络，该网络就是微生态系统的多维空间结构。
动物胃肠道微生物菌群与动物胃肠道环境和动物所处的外界环境密切相关，形成一个有机整体。动物胃肠道菌群与动物生长健康之间有密切的关系，随着科学技术的不断发展，研究胃肠道菌群的手段不断创新。目前，研究手段主要为常规的分离培养技术和分子生物学方法。
4.1 常规分离培养技术
常规分离培养技术是将样品直接接种于不同种类的培养基或培养液中，通过生物化学方法将分离纯化到的不同微生物进行分类学鉴定和数量分析。分离培养技术是研究动物胃肠道微生态不可或缺的方法，通过分离培养技术可以获得纯培养物，并对微生物的组成、数量及其特性进行研究，获得比较全面的信息，为理论研究和生产实践提供重要的依据。
然而该方法同时也存在局限性，环境微生物很多是不可培养的，大多数厌氧微生物未被鉴定和描述，而且常规分离培养技术操作过程繁冗。其缺陷概括为以下几个方面：(1)大部分微生物不能通过人工培养，可培养的细菌中也近有20％无法定性分析；(2)体外培养的微生物与其在自然状态下的形态和特征存在差异；(3)分离培养技术操作过程繁冗。传统分离培养方法鉴定细菌生长至少要12-24 h，而一些细菌生长较慢，营养要求高，鉴定所需时间更长。纯化需要时间更长，至少需要3 d，多则15 d以上。细菌生化鉴定过程，生化试剂较多，鉴定后对比工作较为繁杂，而且鉴定结果与人的主观因素有很大关系。
因此，常规分离培养方法无法获取消化道菌群的全面信息，必须结合其他有效的方法更加全面的深入研究。
4.2 分子生物学方法
微生态区系的研究及其群落多样性分析是微生物生态学研究内容，能准确、方便、快速地鉴定环境中的微生物个体，并对复杂群落结构和演替规律进行评价和分析。现今较成熟的技术有遗传指纹、基因序列分析、全细胞原位杂交和定时定量PCR技术等。
4.2.1 16S rRNA技术在生物进化过程中，生物的核糖体RNA保持恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序，与进化过程突变频率一致，在结构上分为保守区和可变区。而原核生物核糖体小亚基的16S rRNA片段长度和碱基排列复杂程度适中，序列分析比较起来较为容易，利用通用引物对保守区部分或全部16S rDNA序列PCR扩增，通过对可变区设计特异性引物或探针进行属、种和株系的区分。
4.2.2 核酸分子杂交技术该技术是利用DNA分子碱基互补配对原理，用特异性的核酸探针与待测样品的DNA或RNA进行杂交，从而来检测特定微生物类群的数量和组成。微生物的检测范围是由探针的特异性来决定的，例如用专一性探针对某一类微生物进行杂交，便可检测出该类群微生物的存在。目前常用的核酸分子杂交技术主要是斑点杂交、荧光原位杂交技术和基因芯片技术。
4.2.3 实时荧光定量PCR技术该技术是指将荧光集团加入到PCR反映体系，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，结合标准曲线对未知模板进行分析的方法。该方法测定的并非是PCR产物，而是由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数(Ct值)，Ct值与模板DNA的起始拷贝数呈反比，能准确定量并反映出真实情况。该技术与其它分子生物学技术相结合，可以定性、定量的研究微生物区系的变化，深入了解微生物菌群与环境之间的相互作用及其动态变化过程，为全面、快速、准确分析鉴定复杂环境中微生物菌群提供了一种新的技术手段。
4.2.4 遗传指纹技术该技术被引入到微生态研究中，逐步克服传统分离培养方法的不足。其中变形梯度凝胶电泳(denatufing gradient gel elec―trophoresis，DGGE)和温度梯度凝胶电泳(tern-perature gradient gel electrophoresis，TGGE)技术是直接利用DNA或RNA对微生物遗传多样性进行分析，可以鉴定出传统方法不能分离到的细菌。该方法能方便、快捷地鉴定环境中微生物个体，并能进行复杂微生物演替规律、种群动态性、基因定位、表达和调控的评价分析。
细菌16S rDNA中有多个片段高度保守，该区域可变区的差异，可以设计细菌通用引物，来扩增细菌16S rDNA片段，区分不同的菌种。16SrDNA是菌群结构分析常用的分子标记技术。
PCR／DGGE技术广泛用于土壤、人类、猪胃肠道、海面、虾及鱼类等菌群结构的研究中，该技术包括样品细菌总DNA的提取、引物及探针的设计、PCR扩增、梯度凝胶电泳、基因文库的筛选、序列测定和序列分析等。
5 猪胃肠道微生物的调控
猪消化道正常菌群的建立对于消化系统的正常发育具有重要的作用，而且正常菌群的建立能够作为生物屏障阻止致病菌的入侵，同时提高猪的免疫力。因此，加强猪胃肠道微生物菌群的研究，在此基础上开发出绿色高效的益生素和化学益生素等调控猪胃肠道微生物菌群，保持胃肠道微生物区的稳定，有望提高猪的抗病力和生产性能。
5.1 益生素
益生素(Probiotics)是一类通过促进肠道微生物平衡对宿主动物产生有益影响的活的微生物饲料添加剂，最早应用于陆生动物。益生素通过产生抑菌物质，如产生细菌素、类细菌素达到抑菌作用；益生素粘附在胃肠道菌(Lactococcus lactis)膜上皮细胞，形成保护性生物膜，有效减少病原菌的定位转移、日粮和黏膜抗原经肠道的转移，避免局部炎症或者是自身免疫感染性疾病的发生，从而促进肠道的修复；另外，益生素有提高机体免疫机能、促进机体营养吸收等作用。研究表明，乳酸菌、芽孢杆菌(Bacillus)、酵母菌等均可作为益生素调控胃肠道微生物的组成。
益生素产品在调控仔猪腹泻疾病中效果较好，但到目前为止，对益生素的研究绝大多数还在使用效果上，对其作用机理研究还不够。专门化和序列化菌种的研制生产，研究益生素对胃肠道菌群的定性、定量和定位的作用机理，对针对性更好的菌种的寻找十分有益。总之，益生素作为一种天然绿色饲料添加剂，没有抗生素的副作用，今后在畜牧业上的应用将更加广泛。
5.2 益生元
益生元(Prebiofics)，狭义来讲益生元主要是寡糖类产品，如果寡糖(FOS)、甘露寡糖(MOS)、异麦芽寡糖(a―GOS或IMO)等。MOS是从啤酒酵母中分离得到，不能被病原菌利用，但却可以激活有益菌，促进肠道菌群向更加有益的细菌和类型转变。日粮中添加MOS能显著改善仔猪生产性能，对仔猪免疫机能也有一定影。FOS是一种非消化性寡糖，在小肠中有选择性吸收能力，可以破坏有害微生物，增加小肠有益菌密度，对挥发性脂肪酸的产生也有一定效果。总之，益生元作为饲料添加剂能调节猪消化道微生物组成，提高猪抗病力和生产性能，但益生元对猪胃肠道微生物菌群的调控机制尚需进一步研究。
5.3 酸化剂(Acidic Agents)
畜禽胃肠道内乳酸菌等有益菌适宜在酸性环境中繁殖，致病菌生长的适宜pH值大多呈中性或偏碱性，因此酸化剂主要是通过降低胃肠道pH值，从而抑制有害微生物繁殖，减少营养物质的消耗和抗生长毒素的产生，同时促进有益菌的增殖。目前，生产中常用酸化剂主要包括单一酸化剂、以磷酸为基础的复合酸化剂和以乳酸为基础的复合酸化剂3种。单一酸化剂中延胡索酸和柠檬酸效果佳；复合酸化剂中以乳酸为基础的复合酸显著优于以磷酸为基础的复合酸。
5.4 其它
日粮、饲喂方式等日常管理上进行胃肠道微生物调控，也可以有效维持动物胃肠道微生态平衡，从而提高猪的生长性能，降低猪发病率，从根本上提高养猪经济效益。
6 展望
虽然猪胃肠道微生态的研究成为当前一个前沿领域，关于胃肠道微生态区系及其调控的研究还较薄弱。这也间接导致了生产中益生素和化学益生素的使用效果不稳定，限制了在猪禽养殖中的应用。因此加强猪胃肠道微生物组成和结构的研究，指导高效益生素、化学益生素和中草药的开发和应用，促进我国畜禽养殖业的同时，还有助于从根本上解决养殖行业中抗生素和其他化学药物的长期大量使用所带来的负面效应，具有重要而深远的意义。
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