基于转录组测序的青蟹寿锦化相关基因分析

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　　摘 要：【目的】以青蟹寿及其全锦突变体qj为材料，研究多肉植物锦化变异分子机理。【方法】利用分光光度计法、转录组测序（RNA-seq），分别测量其叶绿素、类胡萝卜素含量及其相关基因的表达水平，并筛选差异显著的相关代谢途径。【结果】结果表明，qj的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素的含量显著下降;对青蟹寿及qj叶片转录组测序分别获得44 988 938和37 271 576 条Reads，经过滤拼接组装得到45 226条Unigene;所得Unigene的Nr注释分类中有26 999条，Swissport注释有20 279条，KOG注释有16 943条，KEGG注释有10 775条;筛选获得表达差异显著基因共20 305条，涉及130个途径，其中21个途径差异显著。筛选得到的叶绿素合成途径（ko00860）、天线蛋白（ko00196）和光合作用途径（ko00195）的基因表达对比分析，结果表明这3个途径的基因普遍显著下调表达。【结论】初步探索了多肉植物锦化变异的转录组信息，筛选到表达差异显著的基因及途径，为进一步研究多肉植物锦化变异机制提供了基础。
　　关键词：多肉植物;锦化突变;转录组;光合作用
　　中图分类号：Q 943.2文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）02-176-08
　　0 引言
　　【研究意义】 多肉植物是茎、叶特别粗大或肥厚，含水量高，并在干旱环境中有长期生存力的一类植物。由于其品种多样、极具个性、栽培简易，因而近几年深受广泛喜爱，消费需求快速增长，推动了国内多肉植物产业的发展[1]。其中百合科Liliaceae瓦苇属Haworthia植物是多年生多肉类常绿草本，全属约有150余个种，世界各地广泛分布。瓦苇属植物叶呈披针形三角状，肉质厚实表面光滑革质有光泽，叶色浅绿，叶上有彩色条纹或彩色星状斑点，十分美丽，具有极高的观赏价值，深受多肉爱好者的追捧[2-3]。常作盆栽植物观赏，极适宜居室、厅堂、阳台摆放装饰，具有清新优雅之美[4]。多肉的叶、茎等部位在生长过程中色素发生缺失或变异，会造成该部位出现黄色、白色、橙色、红色斑纹或斑块。这种“斑锦变异”现象实质上是植物的一种病态，但在植物中，这种病态却有着另类的美。因其植株体内含有色素较少，生长缓慢，较为珍贵，某些斑锦品种的价格往往是原种的数倍、数十倍，甚至上百倍[5-6]。因此研究多肉植物的“斑锦变异”具有较高的市场价值。【前人研究进展】 多肉“斑锦变异”的本质是叶绿素的缺失，目前对植物组织中叶绿素含量测量方法已经得到广泛使用及发展，如理化测量、接触式测量、非接触式测量等，每种方法都有优缺点，需根据实际情况选择 [7]。其中用分光光度计法测定样品中叶绿素和类胡萝卜素含量是较为传统、被广泛认可的使用方法[8-10]。目前叶绿素合成途径已广为人知，有研究报道，光照和植物内源激素互作共同调控拟南芥种苗中叶绿素生物合成[11-12]。而且模式植物中相应分子调控机制初步建立[13-14]。因此，笔者在此基础上对叶绿素合成缺陷突变体进一步研究。【拟解决的关键问题】 目前由于对多肉植物锦化变异分子机理研究甚少，其锦化变异过程中基因表达差异尚无报道，是否存在关键基因起作用等問题值得探索。【本研究切入点】 随着生物信息学的发展，转录组高通量测序技术日益成熟，成为研究多肉锦化变异的重要工具[15-18]。本研究以青蟹寿Haworthia magnifica及全锦突变体qj为研究对象，检测并分析其叶绿素及类胡萝卜素含量差异，并利用高通量测序技术筛选分析差异表达的基因及途径，为后续锦化变异的分子机理研究提供基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　以高3 cm的青蟹寿及全锦突变体叶片为材料（图1-A），野生型为WT，突变体命名为qj。
　　1.2 仪器和药品
　　CaCO3、石英砂和异丙醇试剂购于西陇化工股份有限公司;滤纸购于杭州富阳北木浆纸有限公司;无水乙醇购于达濠精细化学品有限公司;Trizol裂解液购于Invitrogen;
　　高速冷冻离心机（型号：1-14K）购于Sigma;微量分光光度计（Nanodrop 2000）购于赛默飞;可见分光光度计（型号：V-1200）购于上海美谱达。
　　1.3 叶绿素和类胡萝卜素含量测定
　　用分光光度计法测定样品中叶绿素和类胡萝卜素含量[19]。具体方法：称取新鲜叶片2.0 g置于研钵中，加入0.5 g的CaCO3和0.5 g石英砂及2 mL 96%乙醇研磨匀浆，再加入96%乙醇10 mL继续研磨至组织成白色。取滤纸一张，放入漏斗中用96%乙醇润湿，把提取液倒入漏斗中，滤液用25 mL量瓶收集，用少量96%乙醇冲洗研钵数次，最后连残渣一起倒入漏斗中。用滴管吸取96%乙醇将滤纸上的叶绿素提取液全部洗入量瓶内，直至滤纸和残渣为无绿色。最后用96%乙醇定容至25 mL。将叶绿素提取液倒入光径1 cm的比色杯内，用分光光度计分别在波长665、649和470 nm下测定吸光度。根据公式分别计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量：Ca=13.95×A665-6.88×A649; Cb=24.96×A649-7.32×A665; C=（1000×A470-2.05×Ca-114.8×Cb）/245。
　　1.4 RNA提取与文库构建
　　采用常规Trizol法提取材料RNA。具体方法：往研钵中加入适量液氮和2.0 g新鲜植物材料，充分研磨至粉末并收集，往粉末加入1 mL Trizol裂解液，用涡旋器充分混匀，使样品充分裂解，混匀后放置摇床中，摇8 min左右。加入200 μL氯仿荡摇匀，4℃ 12 000 r·min-1离心10 min。取上清液加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃沉淀过夜。4℃ 12 000 r·min-1离心15 min。弃上清，加0.5 mL 75%乙醇，洗涤沉淀，重复1次。4℃ 8 000～10 000 r·min-1离心5 min（小心倒出上清）。短暂离心，用移液枪吸干乙醇，真空干燥2 min。加30 μL ddH2O，室温溶解5 min，混匀后短暂离心。微量分光光度计（Nanodrop 2000）检测浓度。-80℃冰箱保存样品。 　　cDNA文库构建和测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。通过Illumina Hiseq 4000测序平台，得到原始读序（Raw reads），经过滤去除部分低质量序列和adapters得到干净读序（Clean reads）。然后借助Trinity 软件根据序列之间的重叠信息组装得到Unigenes。
　　1.5 基因表达量计算、注释、分类和途径分析
　　通过RPKM（Reads Per kb Million reads）值计算定量Unigenes的表达，公式为RPKM=106×C/（N×L/1 000），C为匹配到某个Unigene的reads数，N为能匹配到所有Unigene的reads总数，L为该Unigene的碱基数。并且以FDR<0.05且|log2FC|>1筛选差异基因。通过BLASTx程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）以e-value<1e-5为阈值在Nr数据库（http：//www.expasy.ch/sprot）、KEGG）、Swiss-prot蛋白数据库（http：//www.genome.jp/kegg）和KOG数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/COG）对Unigenes注释。基于Nr注释，借助Blast2GO软件对GO注释分析[20]。然后通过WEGO软件对Unigene分类[21]。
　　2 结果与分析
　　2.1 叶绿素a、b和类胡萝卜素含量比较
　　通过分光光度计法测得WT叶绿素a、b和类胡萝卜素平均含量分别为0.178、0.097、0.049 mg·g-1;然而qj对应含量仅为0.003、0.003、0.002 mg·g-1，分别降低了98.56%、96.74%、95.66%。显著性差异分析表明突变体中叶绿素a、b含量极显著降低，类胡萝卜素显著降低（图1），突变体中几乎无叶绿素a、b和类胡萝卜素积累。由于野生型与突变体均在相同的环境中萌芽及生长，显示这极有可能与色素合成途径的基因表达差异相关。2.2 转录组测序与序列拼接
　　对野生型和突变体cDNA文库测序，分别获得Raw Reads数44 988 938和37 271 576，过滤后Clean Reads数分别为43 871 136（97.52%）和36 263 612（97.30%），Q20值分别为98.38%和98.35%，Q30值分别为94.88%和94.82%，G+C含量分别为49.52%和48.86%（表1）。表明测序结果良好。
　　借助trinity软件对滤后序列进行Denovo拼接，共获得45 226条Unigene，最长为16 566 bp，最短为201 bp，平均长度为875 bp，N50为1 507 bp。表明拼接结果良好（图2）。
　　2.3 Unigene功能注释与分类
　　使用Blast将Unigene与Nr、Swiss-prot、KEGG和KOG四大数据库比对，共注释27 474条Unigene（图3-A）。GO功能分類体系中共有2 975条Unigene被注释到，被分配到GO条目下14 233次，可分为生物过程（6226）、分子功能（3069）、细胞组分（4911）三大类下40个功能（图3-B）。在KOG注释中，有16 943条Unigene被分配到KOG条目下25个功能类别28 761次（图3-C）。表明注释分类结果良好。
　　2.4 差异表达基因分类富集分析
　　以FDR<0.05且|log2FC|>1为阈值筛选差异显著基因，获得20 305条（44.90%）差异显著Unigene，其中9 176条（45.19%）Unigene显著上调，样品相关性为0.428 1（图4-A）。
　　差异显著基因GO富集分析结果表明差异基因GO功能分类体系下生物过程（3123）、分子功能（1546）、细胞组分（2724），上下调Unigene排名前10依次为：代谢过程（885）、催化活性（815）、细胞过程（730）、细胞（616）、细胞组分（616）、单有机体过程（595）、结合（549）、细胞器（448）、细胞质膜（283）、细胞器组分（228）（图4-B）。显示qj差异主要表现在代谢过程、酶促反应及细胞组分。
　　对显著差异基因KEGG富集分析表明光合作用途径（ko00195）差异最显著（Pvalue和Qvalue均为0）且富集程度较高（Rich factor =0.87）。此外，Pvalue和Qvalue均<0.05的差异显著pathway共有21个，其中有淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、戊糖与 转换（ko00040）、脂肪酸合成（ko00061）、类黄酮合成（ko00941）、天线蛋白（ko00196）、二萜生物合成（ko00904）、脂肪酸代谢（ko01212）、泛醌和其他萜类化合物-醌生物合成（ko00130）等。显示了这些差异极有可能是由光合作用途径（ko00195）作为关键途径主导其他途径基因的差异表达。
　　2.5 光合作用相关差异基因表达分析
　　对光合作用途径基因表达分析表明该途径上的63个基因有46个表达差异显著，且均表达下调，涉及光系统I（13/16）、光系统II（17/27）、细胞色素b6/f复合体（5/8）、光合作用电子传递链（4/4）、F型ATP酶（7/8）。其中|log2FC|≥2（即表达下调4倍以上）的基因有41个（89.13%），|log2FC|≥3（即表达下调8倍以上）的基因有33个（71.73%），其中的petD、psbT、psb28下调最为明显（图5）。qj光系统中基因普遍显著下调表达，说明qj光合效率下降显著。
　　对光系统I和光系统II的天线蛋白的基因表达分析表明天线蛋白涉及的12个基因有11个（lchb7除外）表达显著下调，且下调程度显著，这11个基因的|log2FC|均≥3（图6）。qj天线蛋白基因普遍显著下调表达，说明qj在光合作用时捕光能力显著下降，这与叶绿素含量显著下降正相关。 　　对叶绿素合成途径的酶基因表达分析表明该途径17个基因有16个下调表达（hemD未检测到），其中|log2FC|>1的有15个（hemB除外），|log2FC|≥2的基因有12个（70.58%）（图7）。qj的叶绿素合成途径酶基因普遍显著下调表达，说明了叶绿素合成酶含量显著降低，这也解释了突变体中叶绿素含量显著降低。
　　3 讨论与结论
　　本研究以多肉植物青蟹寿为试验对象，通过分光光度计法表明突变体qj叶绿素a、b和类胡萝卜含量均极显著降低。借助高通量测序，从WT及qj转录组测序库中分别获得44 988 938和37 271 576 条Reads，Q30值分别为94.88%和94.82%，G+C含量分别为49.52%和48.86%，表明测序结果良好;经过滤拼接组装出45 226条Unigene，最长为16 566 bp，最短为201 bp，平均长度为875 bp，N50为1 507 bp，拼接结果良好;所得Unigene注释Nr分类中26 999条，Swissport注释为20 279条，KOG注释为16 943条，KEGG注释为10 775条，注释分类结果良好。
　　筛选获得差异Unigene共20 305条，涉及130个途径，其中21个途径差异显著，包含了叶绿素合成、天线蛋白和光合作用3个途径，其余18个途径的基因表达差异不一致。进一步分析3个途径基因表达，结果表明光合作用途径的63个基因有46个基因表达显著下调;天线蛋白的12个基因有11个基因表达显著下调;叶绿素合成途径的17个酶基因有16个基因表达显著下调。因此，qj的叶绿素合成、天线蛋白含量、光合作用相关蛋白含量显著降低，进而降低qj的光合作用能力，并以此作为关键，最终影响其他基因的表达。然而，影响这3个途径基因的相关因素有待进一步研究，可能存在某个或某些关键因子起重要作用，也可能与某些基因的DNA甲基化有关，这些均值得进一步研究。
　　本研究初步探索瓦苇属锦化变异的转录组信息，筛选并分析表达差异显著的基因及途径，为进一步研究多肉植物锦化变异机制提供了基础。但由于该机理复杂，受影响潜在因子众多，相关转录调控机制有待进一步研究证实。
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　　（责任编辑：黄爱萍）
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