麦门冬汤加减方联合顺铂对Lewis肺癌移植瘤模型小鼠的抑瘤作用及机制研究

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　　摘 要 目的：研究麥门冬汤加减方联合顺铂对Lewis肺癌移植瘤模型小鼠的抑瘤作用，并探究其可能的作用机制。方法：通过腋下接种Lewis肺癌细胞复制Lewis肺癌移植瘤小鼠模型。将60只小鼠随机分为模型组（生理盐水，每天灌胃1次）、顺铂组（6 mg/kg，每周腹腔注射1次）、麦门冬汤加减方组（20 g/kg，每天灌胃1次）和联合组（每周腹腔注射6 mg/kg顺铂1次+每天灌胃20 g/kg麦门冬汤加减方1次），每组15只。所有小鼠均连续给药2周。给药结束后，检测各组小鼠瘤质量和胸腺指数，苏木精-伊红（HE）染色后观察其瘤体组织病理变化，TUNEL法检测其瘤体细胞凋亡指数，Western blot法检测其瘤体组织中B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）和促凋亡基因Bax蛋白表达。结果：与模型组比较，麦门冬汤加减方组、顺铂组和联合组小鼠瘤质量、Bcl-2蛋白表达量均显著降低（P<0.05），胸腺指数、瘤体细胞凋亡指数、Bax蛋白表达量均显著升高（P<0.05）；并且联合组小鼠瘤质量、Bcl-2蛋白表达量明显低于麦门冬汤加减方组和顺铂组（P<0.05），胸腺指数、瘤体细胞凋亡指数、Bax蛋白表达量明显高于麦门冬汤加减方组和顺铂组（P<0.05）。HE染色结果显示，麦门冬汤加减方组、顺铂组和联合组小鼠肿瘤细胞密度有所降低，肿瘤组织坏死区域增多，并且联合组小鼠的坏死区面积明显大于麦门冬汤加减方组和顺铂组。结论：麦门冬汤加减方可通过下调瘤组织中Bcl-2蛋白表达和上调Bax蛋白表达，从而抑制Lewis肺癌移植瘤模型小鼠肿瘤的生长。
　　关键词 麦门冬汤加减方；顺铂；Lewis肺癌；移植瘤；B细胞淋巴瘤2；小鼠
　　Study on Inhibitory Effect of Modified Maimendong Decoction Combined with Cisplatin on Lewis Lung Cancer Transplantation Model Mice and Its Mechanism
　　FANG Fang1，2，WU Wanyin1，3，YANG Chunxu2，NING Xuejian2，XIE Lingli1，SI Tao2（1.Second Clinical Medical College， Guangzhou University of TCM， Guangzhou 510006， China；2.Dept. of Oncology， Liuzhou Hospital of TCM， Guangxi Liuzhou 545000， China；3.Dept. of Oncology， Fangcun Branch， Guangdong Provincial Hospital of TCM， Guangzhou 510370， China）
　　ABSTRACT OBJECTIVE： To study the inhibitory effect of modified Maimendong decoction combined with cisplatin on Lewis lung cancer transplantation model mice， and to explore its potential mechanism. METHODS： Lewis lung cancer transplantation mice model was induced via subaxillary inoculation of Lewis lung cancer cells. 60 mice were randomly divided into model group （normal saline， once a day， i.g.）， cisplatin group （6 mg/kg， once a week， i.p.）， modified Maimendong decoction group （20 g/kg. once a day， i.g.） and combination group （cisplatin 6 mg/kg， once a week， i.p.+modified Maimengdong decoction， once a day， i.g.）， with 15 mice in each group. All mice were treated for consecutive 2 weeks. After medication， tumor weight and thymus index were detected； HE staining was used to observe the pathological change of tumor tissue. TUNEL was used to detect apoptotic index of tumor tissue. The protein expressions of Bcl-2 and Bax were detected by Western blot assay. RESULTS： Compared with model group， tumor weight and protein expression of Bcl-2 were decreased significantly in modified Maimengdong decoction， cisplatin group and combination group （P<0.05）， and thymus index， tumor apoptotic index and the protein expression of Bax were increased significantly （P<0.05）. Tumor weight and protein expression of Bcl-2 in combination group were significantly lower than modified Maimengdong decoction group and cisplatin group （P<0.05）； thymus index， tumor apoptotic index and the protein expression of Bax were significantly higher than addition and subtraction of modified Maimengdong decoction group and cisplatin group （P<0.05）. HE staining showed that the density of tumor cells was decreased to certain degree in modified Maimengdong decoction group， cisplatin group and combination group； the area of necrosis area in the combination group was significantly larger than in modified Maimendong decoction group and cisplatin group. CONCLUSIONS： Modified Maimendong decoction can inhibit the growth of Lewis lung cancer transplanted tumor in mice by down-regulating the protein expression of Bcl-2 and up-regulating the protein expression of Bax. 　　KEYWORDS Modified Maimendong decoction； Cisplatin； Lewis lung cancer； Transplanted tumor； Bcl-2； Mice
　　肺癌是一种涉及遗传及环境等多种因素的复杂病变过程，尤其与癌基因活化及抑癌基因失活密切相关[1]。B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）是临床公认的肺癌原癌基因之一，其与促凋亡基因Bax共同影响着癌细胞的凋亡进程[2]。中医认为肺癌的发病机制与痰瘀密切相关，肺癌患者局部伴气滞、痰凝以及毒聚之改变[3]。麦门冬汤主要由麦冬、半夏、人参、甘草、粳米和大枣组成，是治燥方剂之一，临床多用于治疗虚热肺痿、咳嗽瘀痰等病。本研究中的麦门冬汤加减方为柳州市中医院肿瘤科肺癌协定方，是在传统麦门冬汤方的基础上去粳米、大枣，加海浮石、百合、白英、瓜蒌皮、玄参、牡蛎、鳖甲、炮山甲和灵芝而成，在柳州市中医院肿瘤科应用多年，并取得了良好疗效。前期笔者在临床应用中发现，麦门冬汤加减方联合化疗治疗气阴两虚痰浊泛肺型非小细胞肺癌能提高疾病无进展率，改善患者生活质量[4]。基础研究也发现，麦门冬汤加减方对肺腺癌细胞化疗具有增敏作用[5]。本研究拟在前期研究的基础上，进一步开展动物体内实验，建立Lewis肺癌移植瘤小鼠模型，探讨麦门冬汤加减方联合顺铂给药后对模型小鼠的抑瘤作用，为进一步阐明其抑瘤机制及其临床应用提供参考。
　　1 材料
　　1.1 仪器
　　PB100高速组织匀浆机（美国Wheaton公司）；Frontier 5000离心机（美国Ohaus公司）；XSP-2C生物显微镜（上海光学仪器厂）；IVIS小动物活体光学成像系统（美国Perkin Elmer公司）。
　　1.2 药品与试剂
　　麦门冬汤加减方汤剂（柳州市中医院制剂室，批号：0612051，规格：200 mL，每1 mL药液中含生药量为1.32 g）；顺铂注射液（南京制药厂有限公司，批号：20070202，规格：20 mg/20 mL）；Bcl-2、Bax多克隆山羊抗人抗体（美国Santa Cruz公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）、小鼠抗地高辛单克隆抗体[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；小鼠抗β-肌动蛋白（β-actin）抗体（上海心语生物科技有限公司）。
　　1.3 动物
　　SPF级C57BL/6J小鼠60只，♀♂各半，鼠龄6周，体质量18～20 g，购自南京斯科瑞生物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（苏）2017-0003。购入后将小鼠饲养于温度为20～22 ℃、相对湿度为50%～70%、明暗各12 h交替的动物房中，饲养期间自由摄食和饮水。
　　1.4 细胞
　　Lewis肺癌细胞由南京大学医药生物技术国家重点实验室提供。
　　2 方法
　　2.1 麦门冬汤加减方的制备
　　分别称取人参15 g、生地黄15 g、海浮石30 g、麦冬15 g、百合30 g、白英30 g、瓜蒌皮15 g、玄参15 g、法半夏10 g、鳖甲30 g、牡蛎30 g、炙甘草6 g、炮山甲10 g和灵芝30 g，将以上诸药纳入煎药机中，水煎400 mL，即得。
　　2.2 Lewis肺癌移植瘤小鼠模型的建立
　　将Lewis肺癌细胞取出，水浴解冻，以含12%胎牛血清的DMEM培养液于温箱内对细胞进行培养，环境设置为37 ℃、5% CO2。待细胞生长至对数期，且台盼蓝染率（即活细胞率）高于95%时，选用胰蛋白酶消化并制备成细胞密度为2×104个/mL的细胞悬液，备用。小鼠常规喂养3 d后，腋下接种上述细胞悬液（0.2 mL/只），复制Lewis肺癌移植瘤小鼠模型，造模1周后可见明显移植瘤者表示造模成功[4]。
　　2.3 分组与给药
　　将60只小鼠随机分为模型组、顺铂组、麦门冬汤加减方组和联合组，每组15只。其中，模型组小鼠灌胃等体积生理盐水；顺铂组小鼠腹腔注射6 mg/kg顺铂注射液，每周给药1次；麦门冬汤加减方组小鼠灌胃20 g/kg麦门冬汤加减方，每天给药1次；联合组小鼠腹腔注射6 mg/kg顺铂注射液（每周给药1次）+灌胃20 g/kg麦门冬汤加减方（每天给药1次）。所有小鼠均连续给药2周。给药剂量根据文献[5]并结合前期预实验结果确定。
　　2.4 瘤质量及胸腺指数测定
　　给药期间，用小动物活体光学成像系统在给药第1、3、7、14天检测肿瘤成像大小并记录信号强弱，计算肿瘤体积[5]。给药结束后，将小鼠过度麻醉处死（处死前再次使用活体成像技术记录瘤快大小），称定其体质量，切除瘤体及胸腺，分别称定其质量，根据以下公式计算胸腺指数：胸腺指数（g/10 g）=胸腺质量（g）/体质量（10 g）[6]。
　　2.5 瘤体组织病理学观察
　　将瘤体样本浸泡于福尔马林内12 h，取出后冲洗，选用酒精脱水，二甲苯透明后，常规包埋并行4 ?m切片，苏木精染色5 min，伊红复染2 min，封片，选用显微镜进行镜检，观察瘤体组织病理学变化。
　　2.6 瘤体细胞凋亡指数检测
　　采用TUNEL法检测瘤体细胞凋亡指数。将瘤体样本切片后，置于染色缸内，二甲苯洗涤2次，随后依次用95%、75%乙醇各洗涤1次。将20 ?g/mL蛋白酶K滴入磷酸盐缓冲液（PBS）内，并加入染色缸中，在室温下反应10 min，取出，PBS洗涤2次，然后置于载玻片上，吸弃多余液体，滴入2 mL 末端脱氧核苷酸转移酶（TDT）缓冲液，室温下反应5 min，PBS洗涤2次，滴入2 mL小鼠抗地高辛单克隆抗体，室温下反应60 min，PBS洗涤2次，二氨基联苯胺（DAB）显色，甲基绿复染，封片镜检；随机选取10个视野，检测阳性染色（细胞核为棕黄色）平均光密度及阳性表达表面积，计算瘤体细胞凋亡指數：凋亡指数（%）=平均光密度×阳性表达表面积×100%。 　　2.7 瘤體组织中Bcl-2、Bax蛋白表达
　　采用Western blot法。将瘤体组织剪碎，PBS洗涤2次，4 500 r/min离心5 min，弃洗涤液，取出样本置于匀浆器内，按组织-蛋白裂解液（1 g ∶ 1 L）进行匀浆后，振荡10 min，随后进行95 ℃金属浴灭活。然后以5 000 r/min离心10 min，取上清，BCA法进行蛋白定量，琼脂糖凝胶电泳并转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，选用Bcl-2、Bax（1 ∶ 50）和β-actin（1 ∶ 500）一抗，-4 ℃冷藏过夜；TBST缓冲液溶液洗膜2次，每次3 min；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 1 000），常温下孵化3 h，TBST洗膜2次，每次3 min，发光后选用凝胶成像系统，以目的蛋白条带灰度值与内参（β-actin）条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。
　　2.8 统计学方法
　　采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 各组小鼠给药不同时间后肿瘤体积测定结果
　　给药第1天，各组小鼠肿瘤体积差异均无统计学意义（P>0.05）。随着给药时间的延长，各组小鼠的肿瘤体积均不断增加。在给药第3、7、14天，与模型组比较，各给药组小鼠肿瘤体积均显著减小（P<0.05），且联合组小鼠肿瘤体积显著小于麦门冬汤加减方组和顺铂组（P<0.05）。给药不同时间后各组小鼠肿瘤体积测定结果见表1。
　　3.2 瘤质量和胸腺指数测定结果
　　与模型组比较，各给药组小鼠的瘤质量均显著降低（P<0.05），胸腺指数均显著升高（P<0.05）；且联合组小鼠瘤质量显著低于麦门冬汤加减方组和顺铂组（P<0.05），胸腺指数显著高于麦门冬汤加减方组和顺铂组（P<0.05）。各组小鼠瘤质量和胸腺指数测定结果见表2。
　　3.3 瘤体病理组织学观察结果
　　模型组小鼠瘤体组织中肿瘤细胞分布密集，细胞核较大、染色深，多呈点状坏死；各给药组小鼠瘤体组织中肿瘤细胞密度均有所降低、坏死区域均增多，且其中联合组坏死区面积明显大于麦门冬汤加减方组和顺铂组，坏死区面积呈大片状。各组小鼠瘤体组织病理学观察结果见图1。
　　3.4 瘤体细胞凋亡指数测定结果
　　与模型组比较，各给药组小鼠瘤体细胞凋亡指数均显著升高（P<0.05），且联合组小鼠瘤体细胞凋亡指数显著高于麦门冬汤组和顺铂组（P<0.05）。各组小鼠瘤体细胞凋亡指数测定结果见表3。
　　3.5 瘤体组织中Bcl-2、Bax蛋白表达测定结果
　　与模型组比较，各给药组小鼠瘤体组织中Bcl-2蛋白表达量均显著降低（P<0.05），Bax蛋白表达量均显著升高（P<0.05）；与麦门冬汤加减方组或顺铂组比较，联合组小鼠瘤体组织中Bcl-2蛋白表达量进一步降低（P<0.05），Bax蛋白相对表达量进一步升高（P<0.05）。各组小鼠瘤体组织中Bcl-2、Bax蛋白表达电泳图见图2，测定结果见表4。
　　4 讨论
　　中医将肺癌归属于“肺痞”“胸痛”等范畴，其病因与正气亏虚、血瘀痰凝、邪毒入肺以及烟毒内蕴等有关[7]。本院在挖掘中医经典古籍基础上，结合肿瘤临床治疗的经验，拟合了麦门冬汤加减方。其中最典型的对药是麦冬与半夏，麦冬滋阴润肺兼清虚火，半夏燥湿化痰兼以散结，两药合用，麦冬使半夏不燥，半夏使麦冬不腻，共奏清肺降逆、活血化痰之功[8-9]，体现了在“燥湿相混致癌论”指导下的燥湿化痰而不伤阴、滋阴清热而不助痰治法在肺癌治疗上的具体应用。在本研究中，给予麦门冬汤加减方后模型组小鼠瘤质量明显低于模型组，表明麦门冬汤加减方具有明显的抑瘤作用，但是其作用不及联用组。
　　Bcl-2是分子量为26 kD，含2个内含子、3个外显子的线粒体膜蛋白，其对多种因素诱导的细胞凋亡具有抑制效应[10-11]。Bcl-2可抑制细胞色素C（Human cytochrome-C，Cyt-C）表达，促使Cyt-C活性下降从而无法激活下游含胱天蛋白酶（Caspase），阻滞Caspase的蛋白质切割能力，以此来减少细胞的凋亡[12]。Bax是分子量为21.4 kD的促凋亡蛋白[13-14]，同属于Bcl-2家族，其可与Bcl-2相互作用形成异二聚体，并以此抑制Bcl-2功能[15]。在本研究中，联合组小鼠瘤体组织中Bcl-2蛋白表达量明显低于麦门冬汤加减方组和顺铂组；与此同时，联合组小鼠瘤体组织中Bax蛋白表达量明显高于麦门冬汤加减方组和顺铂组。该结果提示，麦门冬汤加减方联合顺铂可在一定程度上促进模型小鼠癌细胞凋亡，从而获得较好的抑瘤效果。并且HE染色结果也显示，给药后模型小鼠瘤体组织中瘤细胞密度有所降低，坏死区域增大，其中联合组小鼠坏死区面积明显大于麦门冬汤加减方组和顺铂组，这表明麦门冬汤加减方联合顺铂给药可有效促进小鼠癌细胞凋亡，抑制小鼠癌细胞增殖。
　　综上所述，麦门冬汤加减方联合顺铂能明显抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长，相关作用可能与下调瘤体组织中Bcl-2蛋白表达和上调瘤体组织中Bax蛋白表达有关，但其更具体的作用机制有待进一步阐明。
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　　（收稿日期：2018-12-28 修回日期：2019-02-24）
　　（编辑：林 静）
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