贵州油茶叶斑病Lasiodiplodia theobromae病原鉴定研究

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　　摘 要：对贵州油茶主要种植区采集到的油茶叶斑病叶片，采用形态学鉴定及多基因分子鉴定的方法，对分离的叶枯病病原菌进行系统鉴定。结果表明：在编码转录延伸因子（TEF）、微管蛋白基因（TUB2）2基因所构建的系统发育树中，KLXYL-3-2菌分别与葡萄座腔菌属KP642037.1、KX464911.1和MG000590.1菌株聚為一个独立的进化分支且置信度为99%，结合其形态特征，将其鉴定为可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。
　　关键词：油茶;可可毛色二孢菌;叶枯病;形态学;分子鉴定
　　文章编号：1004-7026（2020）01-0090-02         中国图书分类号：S435.711         文献标志码：A
　　 油茶是贵州省农业产业革命的特色产业之一，截至2019年9月，贵州油茶现有26个品牌。随着油茶基地规模逐渐扩大、低产林改造和油茶精深加工水平提升，油茶产业的重要性日渐凸显，病害防控工作的重要性得以体现。油茶叶斑病发病症状包括枝枯、根腐、枯萎、叶斑及丛枝等。刘小玉等（2019）[1]报道海南油茶叶斑病的病原为可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。任亚峰等（2019）[2]报道在贵州茶树叶斑病的病原为可可毛色二孢（L.theobromae）。目前，贵州未见由可可毛色二孢菌引起的油茶叶斑病的相关报道。
　　 可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）属葡萄座腔菌属（Botryosphaeria）病原菌的无性型[3]。葡萄座腔菌的一些种是弱势致病菌，它们一般不会直接侵染寄主植物，但作为叶枯病致病菌的可可毛色二孢菌广泛分布在热带和亚热带地区，寄主十分广泛。本试验通过病叶组织分离法对病原菌进行分离、培养，并对其开展形态学及分子生物学研究，旨在明确病原菌种类，为探明其发生传播规律及防治奠定研究基础。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　 2015—2018年采集油茶叶斑病叶片标本于黔东南州凯里市、锦屏县及黄平县，以及铜仁市石阡县、江口县及思南县，分别集中于6—7月、10—11月采集病样，典型病征（图1）。发病初期叶缘变色，向内叶蔓延;发病后期病斑淡褐色，病部和健康部分界线明显，病斑凹陷，逐渐扩大成不规则病斑。
　　1.2  方法
　　1.2.1  病原菌的分离纯化
　　 常规组织分离法：先用75%的酒精处理病健交界的组织，0.1%升汞溶液消毒，无菌水漂洗干净，PDA培养基纯化培养，置于4 ℃下保存备用。
　　1.2.2  病原菌的形态鉴定
　　 取5 mm菌饼，在PDA平板28 ℃光照16 h培养，2～5 d连续观察菌落的形态、颜色。取10 μL分生孢子悬浮液，在光学显微镜下观察记录其大小及形态特征。
　　1.2.3  分子鉴定与系统发育分析
　　 取20 mg菌丝经液氮研磨，样品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的试剂盒，Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒SK8259。扩增引物如下：Bt2a5’GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3’，Bt2b5’ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3’;EF1F5’GTCGTYGTYATYGGHCAYGT3’，EF1R5’ACHGTRCCRATACCACCRATCTT3’。
　　 将测序rDNA-TEF和rDNA-TUB2序列与GenBank中相关序列分别用ClustalX1.83软件进行比对分析。选出与各分离菌株相似度较高的相应序列，采用MEGA7.0.14软件中的最大简约法（MP）做聚类分析，把所有碱基状态处理为无序，并给以相同权重。自举检验重复1 000次以获得各分支的支持率，构建系统发育树。
　　2  结果与分析
　　2.1  病原菌菌落与形态特征
　　 采用常规组织块法分离得到菌株编号为KLXYL-3-2。菌株KLXYL-3-2在PDA培养基平板形成圆形或近圆形菌落。菌落正面呈棉絮状，初生菌丝灰白色，边缘蓬松，气生菌丝生长旺盛，菌落后期转墨绿色或浅黑色，36～48 h菌丝即可布满整个PDA平板（图2A）。菌落反面可见灰黑色，甚至黑色（图2B）。子座呈圆球状或棍棒状，大小为（1.8～9.2）？滋m×（1.9～3.8） mm。子座内有多个分生抱子器。
　　 分生孢子为单孢，呈卵圆形或椭圆形，大小约为（12.5～16.2） ？滋m×（19.5～28.8） ？滋m，早期无色似透明（图3）。
　　 这些形态特征与刘小玉等人描述可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）形态特征基本一致。因此，初步确认菌株KLXYL-3-2为可可毛色二孢菌。
　　2.2  分子鉴定
　　 以叶斑病病原菌6个菌株的DNA为模板，对编码转录延伸因子（TEF）、微管蛋白基因（TUB2）进行扩增并测序。分别与GenBank中同属菌株序列进行同源性比较，确定6个菌株同属于可可毛色二孢菌（L.theobromae），与形态学鉴定结果一致。
　　 代表菌株KLXYL-3-2的TEF和TUB2基因与其他同属菌株的序列经最大简约法（MP）共同构建的系统发育树中，分别与可可毛色二孢菌（L.theobromae）菌株（KP642037.1、KX464911.1和MG000590.1）同源性高达99%～100%，进化分析聚在同一分支上，能与同属其他菌株明显区分开。因此，根据分离病原物的形态学特征，结合单基因（TEF-TUB2）系统发育学鉴定结果，将KLXYL-3-2鉴定为可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。
　　3  结论与讨论
　　 本研究所鉴定的油茶可可毛色二孢菌（L.theobromae），在贵州油茶叶枯病的相关研究属于首次报道。田间调查期间发现，可可毛色二孢菌在油茶树叶片、嫩茎上发病迅速，病斑扩展速度快，染病后期叶片枯萎、脱落，今后可能会上升为贵州油茶产区的主要病害。
　　参考文献：
　　[1]刘小玉，余凤玉，付登强，等.油茶叶斑病菌的分离、鉴定及生物学特性研究[J].中国热带农业，2019（86）：38-42.
　　[2]任亚峰，包兴涛，李冬雪，等.茶树叶斑病病原菌可可毛色二孢菌的鉴定[J/OL].http：//kns.cnki.net/KCMS/detail/11.2184.Q.20190304.1052.001.html.
　　[3]Punithalingam E.Plant diseases attributed to Botryodiplodia theobromae Pat [J]. Bibliotheca Mycologia，1980（71）：1-123.
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