TSA诱导橡胶树次生乳管分化过程qRT-PCR内参基因的筛选

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　　摘  要：橡胶树乳管分化过程中差异表达基因的鉴定对于进一步认识乳管分化的分子机理具有重要的作用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）是进行基因表达分析的常用技术手段，合适内参基因的选择是准确进行基因表达定量的前提。以组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A， TSA）诱导橡胶树次生乳管分化的实验系统，采用qRT-PCR技术分析TSA处理橡胶树萌条及对照内层树皮中22个候选内参基因的表达情况。结果显示：TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中，稳定性最高的3个基因分别为UBC3、UBC4和eIF1Aa，而稳定性最差的3个基因分别为ROC3、PTP、CYP2。以UBC3、Actin和ROC3基因为内参，分析组蛋白去乙酰化酶基因HDA1和HDA2在TSA处理下树皮中表达量相对于对照的变化，结果初步证实TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中，UBC3是最佳的内参基因，ROC3不适合作为内参基因。
　　关键词：巴西橡胶树;乳管分化;曲古抑菌素A（TSA）;内参基因
　　中图分类号：S794.1      文献标识码：A
　　Selection of Reference Genes for Normalization of Quantitative Real-time PCR Analysis in Secondary Laticifer Differentiation Induced by Trichostatin A in Rubber Tree （Hevea brasiliensis Muell. Arg.）
　　WU Shaohua， ZHANG Shixin， YANG Shuguang， TIAN Weimin*
　　Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Breeding Base of Cultivation and Physiology for Tropical Crops， Haikou， Hainan 571101， China
　　Abstract： The identification of differentially expressed genes associated with laticifer differentiation is crucial for understanding the molecular mechanism of laticifer differentiation. The selection of a suitable reference gene is a precondition for accurate gene expression analysis by quantitative real-time PCR （qRT-PCR）. In the present study， the expression stability of 22 candidate reference genes were evaluated on the basis of TSA-induced secondary laticifer differentiation using geNorm and NormFinder algorithms. According to the analysis of geNorm and NormFinder， UBC3， UBC4， eIF1Aa were the top three stable genes and ROC3， PTP， CYP2 were the last three stable genes in the process of TSA-induced secondary laticifer differentiation. The expression patterns of HDA1 and HDA2 in TSA treated bark were analyzed based on UBC3， Actin and ROC3 as the reference gene respectively. The results showed that UBC3 could serve as a qRT-PCR reference gene to analyze the gene expression pattern in TSA-induced secondary laticifer differentiation. And ROC3 was not suitable as reference genes for qRT-PCR.
　　Keywords： Hevea brasiliensis Muell. Arg.; laticifer differentiation; trichostatin A; reference genes
　　DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.012
　　巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.），简称橡胶树，是一种大戟科橡胶树属多年生热带乔木，是天然橡胶的主要来源。天然橡胶是在乳管细胞中合成和积累的。乳管细胞之间的细胞壁融合，形成互相连通的网状结构—乳管。在天然橡胶生产中，通常是通过周期性切割橡胶树树干树皮，收集从乳管伤口处流出的胶乳来提炼天然橡胶。橡胶树的乳管数量与橡胶树品种的遗传特性有关，与天然橡胶产量显著正相关，是橡胶树产量育种的重要指标之一[1]。因此，进行橡胶树乳管分化调控机理的研究对于改良橡胶树品系的遗传特性具有重要的意义。橡胶树乳管是由形成层细胞分化而来的，研究表明，机械伤害、茉莉酸及冠菌素（一种茉莉酸类似物）均能诱导次生乳管的分化[2-5]。最近的研究证实，1种组蛋白去乙酰化抑制剂—曲古抑菌素A（trichostatin A， TSA）也能诱导次生乳管的分化，表明组蛋白乙酰化在橡胶树次生乳管分化中起著重要的作用[6]。然而，关于组蛋白乙酰化对乳管分化的调控机理了解的较少。 　　差异表达基因的筛选是进行分子调控网络构建和基因功能研究的前提。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR， qRT-PCR）技术由于具有低成本、高精确性及其高灵敏度等特点[7]，已成为基因相对定量表达分析最常用的技术。但qRT-PCR也有缺点，即合适内参基因选择是准确定量基因表达的前提。理想的内参基因应在不同的处理下及不同类型样品均能较稳定地表达[8]。但已有的研究证实，生物体内基因由于在不同的环境及不同的组织中行使功能的不同，并没有真正的、完全稳定的内参基因[9-10]。因此，为获得准确的基因表达数据，每进行一项实验，都应评估以选择出当前条件下合适的内参基因。截止至目前为止，关于橡胶树内参基因评估的报道主要是针对胶乳的再生、排胶效应、不同基因型、不同组织、不同激素处理及逆境等[11-14]。关于形成层分化乳管过程内参基因的评估只见报道了1例，即冠菌素诱导橡胶树萌条树皮乳管分化系统内参基因的评估，结果显示HbUBC2a在冠菌素（coronatine， COR）诱导次生乳管分化的实验系统中表达最稳定[15]。为进一步完善乳管分化实验系统内参基因的筛选和为构建组蛋白乙酰化调控橡胶树次生乳管分化的基因调控网络筛选合适的内参基因，本研究利用TSA诱导次生乳管分化的实验系统，采用geNorm[16]和NormFinder[17]评估橡胶树18s ribosomal RNA（18S）、actin、actin de po ly merizing factor（ADF，ADF4）、cyclophilin（CYP2）、eukaryotic translation initiation factor（eIF1Aa、eIF1Ab、eIF2、eIF3）、F-box family protein（FP）、trosine phosphatase（PTP）、DEAD box RNA helicase（RH2a、RH2b、RH8）、cytosolic cyclophilin（ROC3）、T-complex protein 1 subunit beta（TCBP）、Ubiquitin-protein ligase（UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3、UBC4）、mitosis protein YLS8（YLS8）持家基因[11]的表达稳定性，以筛选出合适的内参基因。
　　1  材料与方法
　　1.1  材料
　　本实验所用材料为巴西橡胶树无性系热研73397萌条，这些材料种植于中国热带农业科学院试验场，每年都被锯断，由茎干基部的潜伏芽长出萌条。萌条的顶芽在一年中活动5～6次，2次活动生长的叶簇中间隔一定长度的无叶茎秆，这种明显的增长形态，称为伸长单位（extension unit， EU）[3-4]。在自然条件下，从顶端往下数第1～2伸长单位中是没有次生乳管[3-4]，因此，第1～2伸长单位常常用来研究次生乳管分化的诱导。
　　1.2  方法
　　1.2.1  材料的处理及RNA的提取  本实验采用萌条第2伸长单位作为处理的部位，用单面刀片轻轻刮去茎表面的角质层，然后分别涂100 nmol/L的TSA（Selleck，USA）和去离子水（CK），再用塑料薄膜包裹进行处理[5-6]，于处理后0.5、1、2、4、8、24、48、72 h采集包含形成层的内层树皮，每个时间点收集9株萌条的样品，3株萌条的样品混合为1个样品，每个时间点3次重复，然后液氮冷冻后80 ℃冰箱保存用于RNA的提取。RNA的提取及痕量DNA的消化采用RNAprep Pure Plant（天根，北京）试剂盒进行。RNA提取后采用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度，NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific，USA）测定RNA的纯度和浓度。取1 ?g RNA采用Reve rt AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit （The rmo Fisher Scientific，USA）进行反转录合成第一链cDNA，获得的cDNA产物稀释10倍后用于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。
　　1.2.2  qRT-PCR候选内参基因及稳定性验证基因的选择  根据橡胶树已报道的内参基因[11-15]，选择22个持家基因（18S、Actin、ADF、ADF4、CYP2、eIF1Aa、eIF1Ab、eIF2、eIF3、FP、PTP、RH2a、RH2b、RH8、ROC3、TCBP、UBC1、UBC2a、UBC2b、UBC3、UBC4、YLS8）作为候选的内参基因。参照已报道的HDA基因[18]，选择HDA1、HDA2基因用于内参基因稳定性的验证，其中候选内参基因及验证基因的引物如表1。
　　1.2.3  基因的qRT-PCR分析  以TSA处理和对照的cDNA为模板，采用SYBR Premix Ex Taq?（TaKaRa，Japan）试剂，基于CFX384 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad公司，USA）平台进行实时荧光定量PCR。反应体系为10 μL体系，包含1 μL模板、5 μL 2×SYBR Premix、10 μmol/L上游引物和下游引物各0.3 μL、灭菌水补足10 μL。每1个PCR反应重复3次，反应程序为：95 ℃预变性2 min;95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环;扩增完后进行产物熔解曲线分析检测扩增产物的特异性，温度为65～ 95 ℃，每循环上升0.5 ℃，连续测定样品的荧光值获得熔解曲线。
　　1.3  数据处理
　　采用geNorm和NormFinder对TSA处理的次生乳管分化的过程进行内参基因稳定性的评估。需要先按照公式Q=EminCp–Cq（E为基因的扩增效率。当扩增效率接近100%时，E通常默认为2。Cq为该基因在各个组织中的Cq值，min Cq为该基因在所有组织中最小的Cq值）将内参基因的原始Cq值转化为相对表达量Q值，然后将Q值导入到geNorm和Normfinder软件进行分析。对于geNorm分析，以基因配对的形式不断剔除最不稳定的基因，得到内参基因的表达稳定值M，M值与内参基因的稳定性呈负相关，即M值越小代表基因的稳定值越高，反之则越低，最后根据M值大小将候选内参基因稳定性进行排序，筛选出最稳定的内参基因，并通过标準化因子配对差异分析Vn/n+1（阈值为0.15）来判定内参基因的最适数目。 　　NormFinder程序则是通过计算基因的表达稳定值（stability value， SV）来评估候选内参基因的稳定性，SV值越小，候选内参基因就越稳定，反之亦然。最后，对2个软件的评估结果进行比较分析。
　　HDA1和HDA2荧光定量表达数据采用one- way ANOVA对处理及对照进行差异显著性分析，P<0.05时即达显著性，用符号*表示;P<0.01时即达极显著性，用符号**表示。
　　2  结果与分析
　　2.1  内参基因定量引物的特异性检测
　　对橡胶树22个候选的内参基因进行RT-PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示候选的内参基因扩增条带单一，片段大小与目的片段大小一致（图1），表明候选的内参引物的特异性扩增较好，符合qRT-PCR实验标准，可用于内参基因的评估。
　　2.2  TSA处理和对照橡胶树萌条内层树皮候选内参基因的转录丰度
　　为了鉴定22个候选内参基因的转录丰度，采用qRT-PCR分析了TSA处理和对照橡胶树内层树皮中内参基因的表达量，根据Cq值预测内参基因的表达丰度，Cq值越小，表达丰度越高。根据候选内参基因Cq值的分布情况，不同的内参基因在内层树皮中的表达丰度存在明显的差异。22个候选内参基因的Cq值介于11.52～ 28.59，其中18S rRNA Cq值最低，表达量最高;FP的Cq值最高，表达量最小。其他内参基因的Cq值介于20～30之间（图2）。
　　2.3  geNorm分析内参基因表达的稳定性
　　geNorm分析结果显示，TSA处理和对照橡胶树萌条内层树皮候选内参基因的稳定性从高到低的排序为UBC3/UBC4、eIF1Aa、RH2b、YLS8、UBC2a、Actin、ADF4、RH8、TCPB、UBC2b、eIF1Ab、RH2a、ADF、eIF3、UBC1、FP、18S、eIF2、CYP2、PTP、ROC3，表明TSA诱导次生
　　乳管分化的实验中，前3组最稳定的基因分别为UBC3/UBC4、eIF1Aa、RH2b，其中UBC3/UBC4是最合适的内参基因。最不稳定的3个内参基因分别为ROC3、PTP、CYP2（图3A）。另外，为了分析内参基因的适合个数，对内参基因的配对差异值进行了分析，结果显示，TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中，V2/3的配对的变异值（pairwise variations）为0.061，小于阈值0.15，可以判定适合作为内参的基因个数为2个（图3B）。
　　2.4  NormFinder分析内参基因表达的稳定性
　　NormFinder分析结果显示，TSA处理和对照橡胶树萌条内层树皮候选内参基因的稳定性从高到低的排序为UBC3、UBC4、eIF1Aa、RH2b、UBC2a、RH8、ADF4、YLS8、Actin、TCPB、eIF3、ADF、UBC2b、FP、eIF1Ab、UBC1、RH2a、18S、eIF2、CYP2、PTP、ROC3，前3个最稳定的基因分别为UBC3、UBC4、eIF1Aa，其中UBC3是最合适的内参基因，稳定性最差的3个内参基因分别为ROC3、PTP、CYP2（图4）。结果表明，在稳定性前3位和后3位的内参基因的评估中，NormFinder分析结果与geNorm分析结果是一致的。因此，在TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中，UBC3是最佳的内参基因。
　　2.5  内参基因的稳定性验证
　　结合候选内参基因的稳定性的评估结果，分别选择稳定性最好的基因UBC3、稳定性最差的基因ROC3及文献报道的内参基因Actin對TSA响应的关键基因HDA1和HDA2基因进行了相对表达量的评估。结果显示，采用UBC3和Actin作为内参，TSA处理下树皮中HDA1和HDA2基因的表达量变化趋势基本一致（图5A，图5B，图5C和图5D）。不同的是以UBC3作为内参，HDA2在TSA处理8 h后表达量相比对照极显著上调（P<0.01）（图5B），而以Actin作为内参，HDA2在TSA处理8 h后表达量相比对照显著上调（P< 0.05）（图5D）。但是，以ROC3作为内参，HDA1
　　A、C、E分别为以UBC3、Actin、ROC3为内参评估的HDA1基因的相对表达量;B、D、F分别为以UBC3、Actin、ROC3为内参评估的HDA2基因的相对表达量。荧光定量表达数据采用One-way ANOVA对TSA处理及对照进行差异显著性分析，
　　*表示P<0.05，即达显著性水平;**表示P<0.01，即达极显著性水平。
　　和HDA2表达量及表达量的趋势都发生了较大的变化（图5E，图5F），且HDA2在TSA处理8 h后表达量相比对照也无显著差异（图5F）。结果表明，内参基因的正确选择对于采用qRT-PCR进行基因相对表达量的定量至关重要，UBC3适合作为TSA处理树皮样品相关基因定量表达的内参。
　　2.6  TSA与COR诱导次生乳管分化过程中内参基因的比较分析
　　因为用于内参评估COR处理及TSA处理的样品是同一时间采集，且2批处理的样品共用同一批对照样品，因此，我们整合2批样品的数据，采用geNorm与NormFinder软件对整合的内参基因数据进行评估，geNorm结果显示eIF1Aa/ UB C2a、RH2b、UBC3、YLS8和UBC4为前5个最稳定表达的基因。NormFinder结果显示UBC3、RH2b、UBC4、eIF1Aa和UBC2a为前5个最稳定表达的基因。其中UBC3、RH2b、eIF1Aa和UBC2a在2个软件中评估结果是重叠的，因此，认为这4个基因在COR和TSA诱导次生乳管分化的过程中基因表达量较稳定，可进一步验证其是否可用于乳管分化基因相对定量表达的内参基因（图6）。 　　3  讨论
　　橡胶树基因组的测序完成为进一步进行橡胶树发育及抗逆等功能基因的挖掘提供数据基础[19]。荧光定量PCR技术是进行基因鉴定研究的必备手段之一。为获得准确的基因表达数据，内参基因的选择就显的尤为重要。只有选择合适、稳定的基因作为内参基因，才能客观、真实地反映基因的相对表达量。理想的内参基因应在不同的基因型植株、不同组织、不同的发育阶段及不同处理下均能恒定表达，但现有的研究显示，并不存在通用性的内参基因。比如，18S rRNA由于基因表达范围广、表达量恒定，常常作为许多植物qRT-PCR分析的内参基因，但在小麦、苜蓿、杜鹃和杂交兰中，18S rRNA并不适合内参基因[20-21]。早期橡胶树qRT-PCR分析也有采用18S rRNA作为内参基因的[22-24]。本研究发现，18S rRNA在树皮中的Cq值较低（Cq=11.52），即表达丰度最高，且其表达稳定性相对较差，表明18S rRNA并不适合作为TSA诱导橡胶树乳管分化的内参，且多份橡胶树内参基因评估的文献[11-15]也证实18S rRNA稳定性相对较差并不适合作为橡胶树的内参基因。
　　本研究基于TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的实验系统，对22个候选的内参基因在TSA处理树皮样品中进行实时荧光定量PCR。除18S rRNA的Cq值较低，其他内参基因的Cq值在树皮中处于20～30之间，与Li等[11]和Chao等[14]在胶乳中检测的Cq值相似，表明22个候选的内参基因表达量适中，适合进行基因表达稳定性的评估。通过geNorm与NomFinder软件的分析，在TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中，UBC3、UBC4、eIF1Aa、RH2b是前4位稳定表达的内参基因。UBC3和RH2b在COR诱导橡胶树萌条次生乳管分化的过程中的表达稳定性也在前4位之中[15]。另外，RH2b还可用于橡胶树不同组织、非生物胁迫和收割逆境处理的内参基因[11-12]。UBC4在胶乳再生和排胶过程中的表达也较稳定[13-14]，eIF1Aa可用于割胶处理条件下胶乳中相关基因表达的内参基因[11-14]。这也说明UBC、eIF和RH基因家族在不同组织及不同处理条件下的表达较稳定。但不同的样品中基因的编号及表达稳定性的排序也不一样，表明在不同样品中进行基因的表达量分析前需要进行内参基因的评估以选择出最佳的内参基因。在本研究中，通过geNorm与NomFinder软件的评估以及对表达稳定内参基因的验证，显示UBC3是TSA诱导橡胶树萌条次生乳管分化的实验系统的最佳内参基因。
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