您好, 访客   登录/注册

关于BCCIP与P53相互作用的研究

来源:用户上传      作者:刘昱彤

  摘 要:BCCIP是一个与BRCA2和p21相互作用的蛋白质,在众多细胞进程中具有重要作用。p53是一种重要的肿瘤抑制基因,也是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。本文通过引入P53基因来研究BCCIP抑制肿瘤的生物学功能,验证BCCIP与P53之间的蛋白相互作用关系。
  关键词:转录调控;BCCIP;P53;抑癌基因;蛋白质与蛋白质相互作用;表观遗传学
  BCCIP是一个与BRCA2和p21相互作用的蛋白质。作为一种新近克隆成功的抑癌基因,BCCIP是细胞生存、基因稳定不可缺少的基因,该蛋白在胚胎发育、细胞周期调控、细胞有丝分裂、DNA同源重组(HR)以及保持基因组稳定性等众多细胞进程中都具有重要作用[1]。截至到目前的研究,在Bio GRID数据库记录的BCCIP相互作用蛋白有50多种,功能涉及多种细胞生物学过程,预示着BCCIP蛋白在更多方面的功能还有待进一步研究。有研究表明,BCCIP基因在乳腺癌、脑神经胶质瘤、喉癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌等组织中的表达量均有降低或不表达[2],提示BCCIP与这些肿瘤的发生相关,也进一步证实了BCCIP可能为一个重要的抑癌基因。
  为了进一步探讨BCCIP的功能和作用机制,我们将研究BCCIP与P53之间相互作用的关键性结构域以揭示BCCIP在肿瘤中发挥的功能。因此,我们引入P53基因来研究BCCIP抑制肿瘤的生物学功能。已有研究证实,BCCIP通过调节p53的转录活性,减少p53四聚体的形成,阻止p53与它的靶基因p21和HDM2的增强子结合。目前P53对P21的调控作用已有充分的研究,我们将着重研究BCCIP对P53的调控作用。在前期数据的基础上,为了进一步阐明BCCIP与P53之间的蛋白相互作用位点,本文拟设计实验:构建BCCIP的真核和原核的表达载体,通过Co-IP和GST pull down等技术找出BCCIP与P53相结合的具体结构域。
  1 材料与设备
  1.1 实验材料
  1.1.1 主要化学试剂
  乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶回DNA收试剂盒、丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸钠(SDS)、D2000 plus DNA ladder、DL500 DNA marker、預染蛋白Marker SM0671、胎牛血清。
  1.1.2 常用试剂成分
  (1)LB液体培养基(1L):10g NaCl,5g酵母提取物,10g胰蛋白胨,调pH至7.4,高压蒸汽灭菌。
  (2)LB固体培养基(1L):LB液体培养基中加入15g琼脂粉。
  (3)SOC培养基(1L):20g胰蛋白胨,5g酵母提取物,2ml 5M NaCl,2.5ml 1M KCl,10ml 1M MgCl2,10ml 1M MgSO4,20ml 1M葡萄糖。
  (4)Amp抗生素:1克Amp,10ml蒸馏水,浓度100mg/ml。
  (5)DMEM培养基(1L):一包粉末DMEM培养基,800ml水,2g NaHCO3,10%血清。
  (6)磷酸缓冲体系(PBS)(1L):NaCl 137mmol/L,KCl 27mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L。用浓盐酸调pH为7.4。
  (7)胰酶:0.25g胰酶,100mlPBS,调PH为7.4。
  (8)50×TAE buffer(1L):Tris 242g,冰乙酸57.1ml,0.5mol/L EDTA(pH 8.0)100ml。
  (9)6×loading buffer(DNA电泳):30mM EDTA,36%(V/V)甘油。
  (10)10×湿转transfer buffer(1L):Tris 14.4g、甘氨酸3.02g、甲醇100ml。
  (11)4×SDS-PAGE Loading Buffer(1L):量取1M Tris-HCl 10ml,称取4g SDS,200mgBPB,20ml甘油。
  (12)PBS(1L):1ml双抗+999ml PBS。
  1.2 实验设备
  低温保存箱、药品保存箱、-80℃冰箱、-40℃冰箱、PCR仪、恒温卧式摇床、紫外分光光度计、超声破碎仪、凝胶成像系统、电泳仪电源、水平电泳槽、迷你离心机、超净工作台、垂直混合器、低速离心机、可见光分析灯箱、恒温培养箱、双垂直蛋白电泳仪、台式离心机、电子天平、涡旋混匀器、琼脂糖凝胶电泳仪、洗片机、超纯水机、制冰机、磁力搅拌器、脱色摇床。
  2 实验思路与方法
  2.1 实验研究思路
  首先我们根据BCCIP和P53的蛋白结构域特征,分别构建了BCCIP和P53的不同截短真核表达质粒,然后在HCT116细胞中共转BCCIP和P53的不同截短质粒,通过COIP实验和免疫印迹检测技术,确定BCCIP与P53相互作用的具体结构域。而后在HCT116细胞中瞬转一定量的P53全长表达质粒和梯度剂量的BCCIP全长表达质粒,通过Western blot检测BCCIP对P53蛋白的稳定性的影响;再用同样的方法瞬转不同的截短表达质粒,检测BCCIP对P53相互作用结构域的稳定性影响,进而揭示BCCIP对P53的调控以及在癌症中的生物学功能。
  2.2 实验研究方法
  2.2.1 质粒构建
  (1)设计BCCIP和P53的截短质粒引物,PCR选择最佳退火温度。(2)DNA电泳并做胶回收。(3)目的片段连接T载体。(4)大肠杆菌转化,蓝白斑筛选,挑菌。(5)PCR检测,选择电泳条带正确的菌株进行小提。(6)送公司进行测序。(7)将连T的Insert和载体分别进行大切胶回收(先小切进行验证)。(8)Insert与Vector连接。(9)质粒转化,挑菌。(10)菌液PCR选取条带位置正确的菌液进行小提。(11)送公司进行测序。   2.2.2 真核表达质粒Co-IP实验
  (1)在HCT116細胞中共转BCCIP和P53的表达质粒。(2)瞬转48小时后收细胞,RIPA裂解液4度裂解6小时。(3)12000rpm,4度,离心1小时,收集裂解后上清。(4)平衡beads,beads与细胞裂解液孵育过夜进行结合。(5)洗脱非特异蛋白,做样,western blot检测。
  3 实验结果分析
  在细胞周期调控中,目前发现BCCIP通过3个途径调节p21蛋白;在同源重组修复中,BCCIP除了通过BRCA2-RAD51蛋白通路外,还可能通过p21蛋白参与细胞周期和细胞周期检查点的调节进而影响同源重组修复[3];在维持基因组稳定性方面,BCCIP下调引起细胞分裂中期染色体断裂和姐妹染色单体交联,从而影响细胞的有丝分裂,抑制细胞的增值。
  One等[4]发现BCCIPα的161-259氨基酸区域与p21的C端149~164氨基酸和CDK2结合后形成三聚体。BCCIPα的过表达通过增强p21抑制CDK2组蛋白H1激酶活性的能力以达到抑制细胞增殖的目的。Meng等[5]发现在细胞内BCCIPβ与p21相互作用可以抑制细胞的生长,并且p21蛋白下调的细胞阻断部分其抑制细胞生长的功能。用RNA干扰技术抑制BCCIP基因表达可引起p21蛋白水平下调,并且使HT1080细胞G1/S周期检查点对电离辐射应答的功能受损。而过表达BCCIPα或BCCIPβ引起p21mRNA水平和蛋白表达的升高,延迟细胞的G1/S期。而增加p21蛋白的稳定性并不会引起BCCIP过表达对P21的影响。p21是p53下游的靶基因,p53是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基肿瘤抑制基因。在所有恶性肿瘤中,该基因有一半以上的概率发生突变。研究者推测p53可能与BCCIP对p21的调节相关,接下来的研究发现沉默p53基因表达后,BCCIP过表达不再引起p21水平升高,说明p53是BCCIP诱导p21表达的关键因素[6]。进一步研究发现,BCCIP对p53的转录活性起着关键的作用,在p53野生型细胞,p53蛋白水平不会因BCCIP蛋白的下调而变化,但是会引起p53转录活性的降低,减少p53四聚体的形成,阻止p53与它的靶基因p21和HDM2的增强子结合[7]。
  本实验根据BCCIP和P53的蛋白结构域特征,分别构建了BCCIP和P53的不同截短真核表达质粒;先用带GFP荧光质粒瞬转以测其瞬转效率,证明其瞬转效率没有问题,然后在HCT116细胞中,通过瞬转本实验构建的质粒。我们检测到质粒在HCT116细胞中瞬转均表达,构建成功;再通过CO-IP实验和免疫印迹检测技术,验证了BCCIP与P53之间的蛋白相互作用关系,进一步论证了BCCIP蛋白会影响DNA损伤的重组修复,G1/S细胞周期调控,细胞有丝分裂和基因组稳定性,这些都说明BCCIP与肿瘤的发生和肿瘤的治疗有着密不可分的关系。
  参考文献:
  [1]邱斌.BCCIP在非小细胞肺癌中的研究[D].北京:中国协和医科大学,2006.
  [2]刘晓霞,刘超英,李晓辕,等.BCCIP在卵巢恶性肿瘤的表达及临床意义分析[J].中国免疫学杂志,2012(3):213-216.
  [3]Meng X,Liu J,Shen Z.Genomic structure of the human BCCIP gene and its expression in cancer[J].Gene,2003,302(1-2):139-46.
  [4]Ono T,Kitaura H,Ugai H,et al.TOK-1,a novel p21Cip1-binding protein that cooperatively enhances p21-dependent inhibitory activity toward CDK2 kinase[J].J Biol Chem.2000,275(40):31145-54.
  [5]Meng X,Liu J,Shen Z.Inhibition of G1 to S cell cycle progression by BCCIP beta[J].Cell Cycle,2004,3(3):343-8.
  [6]Meng X,Lu H,Shen Z.BCCIP functions through p53 to regulate the expression of p21Waf1/Cip1[J].Cell Cycle,2004,3(11):1457-62.
  [7]Meng X,Yue J,Liu Z,Shen Z.Abrogation of the transactivation activity of p53 by BCCIP down-regulation[J].J Biol Chem,2007,282(3):1570-6.
  基金:吉林大学2019年省级大学生创新创业项目(项目编号:201910183791)
转载注明来源:https://www.xzbu.com/1/view-15204911.htm