蛹虫草种子液的培养条件筛选
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摘 要：通过对蛹虫草种子液培养的碳源、氮源、培养温度、初始pH值、摇床转速等指标进行考察，筛选利于蛹虫草种子液菌丝体生长的条件。实验结果表明：培养蛹虫草种子液最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨，最适初始pH为6.0，最适摇床转速为150r/min，最适培养温度为26℃左右。
关键词：蛹虫草;种子液;培养条件
中图分类号：S-3
文献标识码：A
蛹虫草（Cordyceps militaris），又称北虫草，与野生冬虫夏草同属肉座菌目[1]。在虫草属中，唯有冬虫夏草和蛹虫草是我国最常见的分布较广的药用价值极高的2种虫草菌[2]。有研究表明，蛹虫草含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、氨基酸、SOD、无机元素等多种有效成分，与冬虫夏草的化学成分基本相同，某些氨基酸和虫草素含量甚至高于冬虫夏草[3，4]。这使得蛹虫草可作为冬虫夏草的良好代替品进行生产和消费，尤其在功能食品和医药等方面具有很好的实用价值。
在蛹虫草子实体培养前需要对其种子液进行活化，而在大规模生产中种子液的需求是十分巨大的，所以种子液的培养条件优化是十分重要的一环。文章旨在通过对碳源、氮源、培养温度、初始pH值、摇床转速等指标进行考察，筛选利于蛹虫草液体菌丝生长的条件，以期为批量制备蛹虫草种子液提供技术依据。
1 材料与方法
1.1 菌株
供试蛹虫草菌株（Cordyceps militaris）为本实验室保藏菌种。
1.2 培养基配方
1.2.1 固體培养基（PDA）
[JP2]马铃薯汁200g/L，葡萄糖20g/L，酵母膏1.0g/L，蛋白胨2.0g/L，[JP]KH2PO4 1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，VBl 0.02g/L，琼脂20g/L，pH6.7，121℃ 0.1MPa蒸汽灭菌30min，用于菌种活化培养[5]。
1.2.2 种子液体培养基
KH2PO4 3.0g/L，MgSO4 1.5g/L，氮源10g/L，碳源20g/L，设定pH，高压蒸汽灭菌30min。
1.3 培养基培养方法
1.3.1 斜面菌种扩培
将固体平板培养基常规灭菌，冷却后，在无菌室内将活化好的供试菌种分别接入固体平板中，在25℃恒温培养箱中暗室培养7d。
1.3.2 种子液培养
在装有100mL高压灭菌冷却后的液体培养基中接入平板活化好的约0.5cm2的3块菌种，在设定温度、pH、转速、碳源、氮源的条件下暗培养5d。
1.4 种子液培养条件筛选
1.4.1 种子液碳源条件筛选
在装有100mL高压灭菌冷却后的液体培养基中接入平板活化好的约0.5cm2的3块菌种，在温度为25℃、pH 6.0、转速150r/min、氮源为蛋白胨、暗培养5d的条件下考察不同碳源（葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖）的影响。
1.4.2 种子液氮源条件筛选
在装有100mL高压灭菌冷却后的液体培养基中接入平板活化好的约0.5cm2的3块菌种，在温度为25℃、pH 6.0、转速150r/min、碳源为葡萄糖、暗培养5d的条件下考察不同氮源（蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硝酸铵、氯化铵）的影响。
1.4.3 种子液初始pH筛选
在装有100mL高压灭菌冷却后的液体培养基中接入平板活化好的约0.5cm2的3块菌种，在温度为25℃、转速150r/min、碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨、暗培养5d的条件下考察不同初始pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的影响。
1.4.4 种子液摇床培养转速的筛选
在装有100mL高压灭菌冷却后的液体培养基中接入平板活化好的约0.5cm2的3块菌种，在温度为25℃、pH6.0、碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨、暗培养5d的条件下考察不同摇床转速（50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min）的影响。
1.4.5 种子液培养温度的筛选
在装有100mL高压灭菌冷却后的液体培养基中接入平板活化好的约0.5cm2的3块菌种，在初始pH 6.0、摇床转速为150r/min、碳源为葡萄糖、氮源为蛋白胨、暗培养5d的条件下考察不同培养温度（20℃、22℃、24℃、26℃、28℃）的影响。
1.5 菌丝测定方法
按1.3中所述方法培养液体菌种，培养结束以1500r/min离心10min，收集菌丝体，用蒸馏水冲洗2～3次，将菌丝球放至已烘干称重的培养皿中，在80℃下烘干至恒重。
2 结果与讨论
2.1 不同碳源对蛹虫草液体菌丝生长的影响
结果如图1所示，在相同的培养条件下，葡萄糖作为蛹虫草液体培养的碳源时菌丝体的产量最高，菌丝球密度最大，菌丝体干重为0.41g/100mL，其次为蔗糖。以麦芽糖为碳源时菌丝体产量最差，菌丝体干重为0.15g/100mL。原因可能是葡萄糖为单糖更容易被微生物所利用。
2.2 不同氮源对蛹虫草液体菌丝生长的影响
从图2中可以看出，在5种氮源中，蛋白胨、酵母膏、牛肉膏都有利于菌丝的生长，菌丝球密度都比较大，菌丝体干重分别达0.44g/100mL、0.37g/100mL和0.41g/100mL;硝酸铵和氯化铵在液体培养中产生的菌丝球少，菌丝体干重只有0.14g/100mL和0.17g/100mL。原因可能是蛋白胨、酵母膏、牛肉膏都属于有机氮源，除含有蛹虫草生长所需的蛋白质、多肽和游离氨基酸直接作为微生物的氮素营养被吸收利用外，还含有少量的糖类、脂肪、无机盐和生长素等其它营养物质，更有利于菌丝体的生长发育;硝酸铵和氯化铵属于无机氮源，对蛹虫草菌丝的生长发育来说不是优势氮源。 2.3 摇床转速对蛹虫草液体菌丝生长的影响
从图3中可以看出，摇床转速在150r/min时，有利于菌丝生长，产生的菌丝球个体均匀且数量多，菌丝体干重达0.43mg/100mL;转速为50r/min时，菌丝体干重达0.23mg/100mL。转速为250r/min时，菌丝体干重为0.28mg/100mL，原因可能是转速小，液体的溶氧量小，菌体生长缓慢不利于菌丝球形成;转速大，溶氧量增大，菌丝生长增多，导致菌丝体扭结在一起，也不利于菌丝体正常生长。
2.4 初始pH对蛹虫草液体菌丝生长的影响
通过调节液体初始pH，对蛹虫草菌种的液体发酵能力进行了考查，结果如图4所示。可以看出菌丝体干重随着pH增大而增大，pH值为6.0时，菌丝体干重达4.0g/L;而趋于碱性时，菌体量下降，所以蛹虫草适合生长在弱酸性培养液中。
2.5 培养温度对蛹虫草液体菌丝生长的影响
通过调节种子液培养温度，对蛹虫草菌种的液体发酵能力进行了考查，结果如图5所示。可以看出菌丝体干重随着温度增高而增大，在培养温度为26℃时，菌丝体干重为0.41g/100mL，但当温度超过30℃时，菌丝体量则下降，即温度过低或过高，均会影响菌体的生长。
3 小结
本实验结果表明，培养蛹虫草种子液最适碳源为葡萄糖，最适氮源为蛋白胨，最适摇床转速为150r/min，最适初始pH为6.0，最适培养温度为26℃左右。
參考文献
[1]梁宗琦，刘爱英，刘作易.中国真菌志（虫草属）[M].北京：科学出版社，2007：137-152.
[2]李军，陈广生，方清茂，李洪水.人工培养蛹虫草与冬虫夏草的比较研究[J].成都中医药大学学报，2010，33（3）：82-84.
[3]马冰如，何玲，张甲生，等.蚕蛹虫草与冬虫夏草化学成分的比较[J].中国食用菌，1994，13（1）：34-37.
[4]李楠，宋健国，刘金云，张宏.蛹虫草与冬虫夏草化学成分比较[J].吉林农业大学学报，1995，17（增刊）：50-53.
[5]邹湘月，罗巍，吴郑武，刘东波，谢红旗.北虫草液体培养基配方的优化[J].食用菌，2012（4）：10-12，31.
（责任编辑 李媛媛）
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