黄河鲤野生和人工养殖群体遗传多样性分析

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　　摘要 采用微卫星技术对黄河鲤选育群体和河南省境内2个野生群体进行遗传多样性分析。在12个微卫星座位上共检测出48个等位基因，3个群体在12个位点的平均遗传分化指数（Fst）为0.04，表明群体分化造成的变异占4%，而96%的变异来源于群体内部。结果显示，3个群体间差异不明显，一方面说明养殖群体在科学的人工选育条件下能够保留一定水平的多样性，另一方面也说明不断恶化的自然环境对野生黄河鲤群体造成的影响是巨大的。
　　关键词 黄河鲤;微卫星;种质资源;野生群体;人工养殖群体
　　中图分类号 Q 31 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2020）16-0091-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.024
　　Genetic Diversity Analysis of Wild and Cultured Population of Cyprinus carpio
　　ZHANG Qin1， SONG Wei2， HOU Zhi-peng2 et al
　　（1.Henan Academy of Fishery Science， Zhengzhou，Henan 450044;2.School of Chemistry and Chemical Engineering， Henan University of Technology， Zhengzhou，Henan 450001）
　　Abstract The genetic diversity of breeding population and 2 wild populations in Henan of Cyprinus carpio were studied by using microsatellite marker technology.  A total of 48 alleles were detected for 12 microsatellite loci. Average Fst of 3 populations at 12 microsatellite loci was 0.04， which showed that the variation caused by group differentiation accounted for 4%， and the internal variation was 96% of the total variation. The results demonstrated that there was no significant difference among three populations. On the one hand， the germplasm resource and the genetic diversity were better in the cultured population， and on the other hand， the worsening environment had great influences on the wild population of C. carpio.
　　Key words Cyprinus carpio; Microsatellite;Germplasm resources;Wild population;Cultured population
　　基金项目 现代农业产业技术体系建设专项（CARS-45-45）;河南省现代农业产业技术体系项目（S2020-10）;国家水产种质资源共享服务平台项目（2020DKA30470）;农业基础性长期性科技工作项目（ZX08S172064）;河南省科技创新体系建设专项。
　　作者简介 张芹（1980—），女，河南新鄉人，高级水产师，硕士，从事鱼类遗传育种研究。
　　收稿日期 2019-12-10
　　黄河鲤是我国著名的四大淡水鱼类之一，有着比较成熟的人工养殖技术。近年来，在河道中捕捞的黄河鲤个体以低龄化、小型化为主，说明酷鱼滥捕现象十分严重，黄河鲤野生资源遭到严重破坏。为了保护黄河鲤的种质资源，开展黄河鲤良种保护和最优线性无偏预测（BLUP）育种工作，需要在物种遗传多态性水平上进行分析。目前关于黄河鲤群体遗传多样性的研究较多[1-7]，而黄河鲤遗传图谱的构建工作已经开展[8-9]，但黄河鲤野生种质资源还未得到充分开发。微卫星标记在鱼类遗传育种研究中有着广泛应用[10-11]。笔者运用微卫星技术对河南省境内野生和人工养殖的黄河鲤群体进行遗传变异研究，旨在对黄河鲤的种质状况进行科学评价，利用分子生物学技术充分挖掘黄河鲤的野生种质资源，为黄河鲤良种的选育提供重要参考，从而对该种质资源进行合理开发、利用与保护。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　野生群体1，采集于河南省长垣县天然文岩渠（属于黄河一级支流），30尾，以下简称“W”群体;野生群体2，取自河南省巩义市伊洛河口，27尾，以下简称“L”群体;人工养殖群体，采自河南黄河鲤鱼良种场，30尾，以下简称“Y”群体。样本剪尾鳍，乙醇保存，提取DNA后-70 ℃下低温保存。
　　1.2 PCR反应
　　DNA的提取使用树脂型基因组DNA提取试剂盒（北京赛百胜基因技术有限公司）。12对微卫星引物[12-14]，均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成，具体信息见表1。
　　PCR反应体系：10 mmol/L 4×dNTPs 200 μmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，引物 0.5 μmol/L，Taq酶 1 U，模板DNA 0.5 μL。PCR反应程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s、55～60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物检测：利用2%琼脂糖凝胶（含Gold view）电泳对PCR产物进行检测，缓冲液为0.5×TBE，使用凝胶成像系统观测并拍照。 　　1.3 数据处理
　　利用POPGENE软件计算各位点等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）和群体Hardy-Weinberg 平衡偏离[2]，根据Botstein 等[15]公式计算多态信息含量（PIC），采用UMGMA法构建系统发生树。
　　2 结果与分析
　　2.1 黄河鲤群体的遗传多样性分析
　　除了引物M24外，其他11组引物均在3个群体中扩增出多态性条带。在11个多态位点上共检测到47个等位基因，不同位点的等位基因数从2个到6个不等，大小为80～345 bp。图1为引物HLJ044对W群体扩增结果的电泳图，表2为3个黄河鲤群体的遗传变异参数。
　　等位基因分布频率的相对稳定是群体处于Hardy-weinberg平衡的一个表现，平衡群体的观测杂合度和期望杂合度不存在显著差异。但是，在实际的野生或养殖群体中[16-20]，等位基因频率或多或少都会偏离Hardy-Weinberg平衡，黄河鲤W和Y 2个群体中有1/3的位点偏离了Hardy-Weinberg平衡。20世纪七八十年代，全国范围内不同品系的鲤鱼间相互引种和杂交现象普遍存在，多种杂交鲤通过各种渠道混入了黄河干支流，河道内野生黄河鲤与其他品种鲤鱼进行杂交，使得野生黄河鲤的种质资源遭到了严重破坏，从而导致黄河鲤品质的下降。Y群体只有一个位点未偏离Hardy-Weinberg平衡，说明高强度的人工选择对这些位点产生了较大的选择压力。该研究中豫选黄河鲤人工选育群体（即Y群体）的遗传变异参数低于鲁翠云等[5]、李超等[6]、李建林等[7]的研究结果，可能是该试验中取样数量较少导致的偏差。
　　黄河鲤3个群体间遗传距离很小，反映出群体间的差异不大，差异主要来自群体内部的多样性。数据显示3个群体在12个位点的平均遗传分化指数（Fst）为0.04，表明4%的变异是由于群体分化造成的，而96%的变异则来源于群体内部，显示了群体内部还存在一定的多样性。顾颖等[1]和王新华等[21]的研究也表明虽然选育群体中大部分位点极显著偏离Hardy-Weinberg平衡，但黄河鲤种内仍保持了较高的遗传杂合度，与该研究结论相一致。该试验结果显示Y黄河鲤群体的多态性略低于其他2个群体，差异并不明显，说明经过多年的人工选择，Y黄河鲤群体仍然保留了一定的多样性。该试验结果显示群体之间基因流大于6，说明黄河鲤野生种群和人工养殖群体之间存在大量基因流，这可能与多年来持续不断的人工放流以及市民的放生行为有关。
　　伊洛河为黄河的支流，水量丰沛，环境相对开放;天然文岩渠虽然也是黄河的支流，但只有在上游水量大时，其径流才流入黄河，当上游水量小时天然文岩渠就形成了一个半封闭的水域。2个野生群体的种质资源除了要面临自然选择外，还要受到诸多人为因素
　　（比如水质污染、酷渔滥捕、天然繁殖场隔离等）的影响，养殖群体混入天然群体后对种质的影响也不容忽視。Y群体是一个经过长达20多年人工定向选择的群体，其面临的选择压力远大于2个自然群体。该试验结果显示虽然3个群体间存在差异，但差异不明显，一方面说明了养殖群体在科学的人工选育条件下能够保留一定水平的多样性，另一方面也说明不断恶化的自然环境对野生黄河鲤群体造成的影响是巨大的。
　　2.2 系统发生树分析和黄河鲤育种的选择
　　所有个体的系统发生树分析如图2所示。Y18作为一个独立分支，遗传距离与其他个体较远，在育种中可以单独使用。Y25～Y29遗传距离较近，属于一个分支。L4、L26、W22、W23、Y2、Y3等不同种群中的个体在同一个分支中出现，可考虑作为近交时亲本使用。W24～W27、W18、W11等文岩渠群体遗传距离较近，属于一个分支。未出现L群体集中出现的分支，笔者认为伊洛河群体是3个群体中个体间遗传距离最远的一个。Y群体为人工繁殖群体，较多个体可以集聚在一起，说明该群体亲缘关系较近。
　　3 结论
　　Spitzweg等[22]运用微卫星技术为北河水龟建立了育种方案;Wang等[23]运用微卫星技术对河川沙塘鳢进行了亲本鉴定。该试验采用微卫星技术对不同来源的黄河鲤进行遗传背景分析，以期建立更加合理的制种策略。目前人工选择育种中一方面需要制备纯种，要利用遗传距离较近的个体做近交;另一方面要减少近交引起的衰退，可以考虑选择亲缘关系较远的不同来源的黄河鲤作为亲本，用来改善人工繁育群体中出现的衰退现象。
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