增塑剂DEHP的神经和行为发育毒性
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作者: 杨艳玲 徐晓虹
摘要：增塑剂邻苯二甲酸二乙基己酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）是一种具有拟雌激素和抗雄激素活性的环境内分泌干扰物，人类和野生动物可通过不同途径终生暴露于DEHP，母体摄入的DEHP可通过胎盘和乳汁转入子代体内并进入脑组织。围生期DEHP暴露性别特异性地改变子代大鼠下丘脑视前区芳香酶活性而影响雌激素合成，并通过改变雌激素受体活性干扰雌激素对脑发育的调节作用。DEHP及其代谢产物可以影响神经细胞的增殖分化和突触形成，干扰性激素调控发育过程中的下丘脑氨基酸递质系统对促性腺激素释放激素分泌的刺激作用，影响中脑多巴胺递质系统发育而诱导自发性多动症。DEHP对脑发育的作用最终影响动物的早期行为、学习记忆和情感等行为发育。
关键词：邻苯二甲酸二乙基己酯；神经发育毒性；环境内分泌干扰物
分类号：B845
邻苯二甲酸酯类（phthalate esters，PAEs）是一种广泛使用的人工合成化合物，因大量用于增加塑料制品的柔韧性和耐用性而被称为增塑剂，全球每年消耗量超过500万吨。PAEs增塑剂中以邻苯二甲酸二乙基己酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate，DEHP）的用量最大，约占总量的40%（singh&Li，2012）。由于DEHP最初被认为是无毒物质，多数国家的卫生法规均无限制地许可其用于各种塑料产品。在聚氯乙烯（PVC）塑膜中，DEHP的用量高达30%-50%。此外，因其良好的溶解性、分散性和粘着性，DEHP还被广泛使用于合成橡胶、涂料、黏合剂、化工合成等其他领域。DEHP与塑料分子间以氢键或范德华力相连，键能较弱，亲脂性强，通过雨水的淋洗、迁移和蒸发等方式释放到环境中（Wang&Dong，2012），使人类和野生动物终生暴露于不同来源的DEHP（Koch，Drexler，&Anger，2003；Australia，NICNAS，2007）。DEHP是一种脂溶性环境内分泌干扰物，其代谢产物结构与内源性雌激素具有一定的相似性，进入人和动物体内可影响内源性性激素的合成与代谢，并可与相应的激素受体结合，干扰内源性激素对机体许多生理活动的调节，因而对人和野生动物产生多方面不利影响，其中主要表现为生殖发育毒性（Piersma，Verhoef，te Biesebeek，Pieters，&Slob，2001；Swan，2008；Li&Zhang，2012）。DEHP的急性毒性小，大、小鼠的半数致死剂量（LDso）约为30g/kg，主要表现为低剂量慢性毒性。欧盟和美国基于动物实验确定DEHP不影响人体健康的极限值（no observable adverse efiect level，NOAEL）为48 mg/kg/day，每日允许摄人量（tolerable dailyintake，TDI）为20 gg/kg/day（柯翔鸿，2008；Commission Regulation（EU）No 412/2012，2012）。然而，据美国毒物与疾病登记署（ATSDR）估算，普通人群经消化道的DEHP最大日摄入量为2mg/kg（Koch et al.，2003；Shea，2003），平均暴露水平在3-30μg/kg/day（Kavlock et al.，2002），德国成人的DEHP的摄入范围为0.03-173μg/kg/day（Fromme et al.，2007），这些值已超过人群所能耐受的慢性暴露水平（TDI，20μg/kg/day）；而职业暴露、医疗暴露和儿童的非饮食暴露量更大。医疗用品很多都含有DEHP，据2000年美国国家人类生育毒性研究报告，重症监护病房接受治疗的患儿DEHP暴露水平可能是普通环境中成人暴露量的2-3个数量级（shea，2003；Guyto et al.，2009）。因此，2011年，欧盟将DEHP等3种PAEs增塑剂作为首批通过的《化学品注册、评估、许可和限制》（REACH）需授权物质正式纳入REACH法规授权名单，中国目前还无相关规定和标准。
人类主要通过食品、医疗用具、水体等途径摄人DEHP，其中人体内超过90%的DEHP是从食品摄入（Wittassek&Angerer，2008）。经口摄入的DEHP一部分以原形直接吸收，其余迅速代谢水解为有活性的单酯MEHP（mono ethylhexyl phthalate，MEHP）（Tickner，Schettler，Guidotti，McCally，&Rossi，2001），后者被认为是DEHP在体内发挥最终毒性效应的主要物质（Koch，Bolt，Preuss，&Angerer，2005；Stroheker et al.，2005）。DEHP在体内的半衰期为12h，而脂肪组织中长达156h（Parks et al.，2000；Australia，NICNAS，2003）。DEHP的生殖发育毒性已引起人们的广泛关注，经过长期大量的实验动物和人体研究，目前已认定包括DEHP在内的PAEs增塑剂可干扰人和动物的内分泌系统，影响野生动物幼体的性腺分化和成体的生殖活动（Li and Zhang，2012），导致人类男性生殖能力减弱、引发女性性早熟（swan，2008）。此外，DEHP还具有一定的胚胎、免疫、肝脏毒性以及致癌作用。
动物的神经系统从胚胎到成年均受性腺激素的调控，器官形成期是胚胎对外界化学物质最敏感的时期，也是神经系统分化发育的关键期。母体摄入的DEHP可通过胎盘和乳汁进入子代体内，而生命早期未发育完全的血脑屏障，使DEHP很容易进入脑组织（xu，Agrawal，Cook，&Knipp，2007）。因此，具有拟雌激素和抗雄激素活性的DEHP有可能干扰内源性性激素对神经系统发育的调节，影响脑的性别分化和成年后的神经活动，但目前人们对这方面的认识还很缺乏。下面就近来DEHP的神经发育毒性研究进展做一简要综述。
1.DEHP对脑内芳香酶合成及雌激素受体活性的影响 在发育阶段，卵巢及其他组织的雌激素分泌功能尚未建立，大脑是胎儿体内雌激素的唯一来源（董朝轩，关云谦，张愚，2006）。神经系统发育过程中，包括下丘脑视前区、皮质、海马、中脑以及杏仁体等在内的大部分脑区神经元都表达雌激素合成的关键酶——芳香酶（aromatase）（Beyer&Hutchison，1997），这些芳香酶可以催化雌激素合成。动物出生前后几天，脑内芳香酶活性、雌激素、以及雌激素受体均达到最高水平，然后逐渐降低至成年水平（McCarthy，2008）。在发育过程中，芳香酶的表达具有时间、脑区和性别特异性，并因此影响脑内雌激素分布的时空和性别差异，从而调节脑发育的性别分化。有人认为，DEHP影响神经系统发育可能是通过影响芳香酶开始的，经抑制芳香酶P450基因（CYP19）的表达而影响脑内雌激素代谢（Lovekamp-Swan&Davis，2003）。Andrade，Grande，Talsness，Grote和Chahoud（2006）观察了DEHP对子代大鼠下丘脑视前区的芳香酶活性的影响，发现不同发育阶段暴露于DEHP对雌性和雄性子代动物产生不同的影响，并与暴露剂量有关。具体而言，围生期母体暴露于低剂量（0.015-1.215mg/kg/day）DEHP抑制1日龄雄性仔鼠的芳香酶活性，而暴露于较高剂量（5-405mg/kg/day）DEHP却增加其活性，但雌性仔鼠芳香酶活性不受影响。与此相反，生后22天，高低剂量DEHP对雌性仔鼠芳香酶活性的影响远大于雄性，无论高低剂量均使雌鼠的活性增加，但只有一个低剂量（0.405mg/kg/day）DEHP增加雄鼠的芳香酶活性。由此可见，围生期DEHP暴露对子代脑内雌激素合成的影响具有发育阶段和性别的特异性。
雌激素参与脑发育过程的许多环节，包括神经细胞凋亡、存活、细胞分化的关键步骤和神经回路的形成（McCarthy，2008）。雌激素在脑发育中的作用存在脑区差异，在某些脑区雌激素促进神经细胞凋亡和突触形成，而在另一些脑区则相反。发育过程中，神经系统表达雌激素a和B受体（ERα和ERβ），细胞内外的雌激素信号可通过这些受体影响神经细胞的活动（Weiser，Foradori，&Handa，2008）。体外研究表明，根据浓度不同，DEHP即可以激活ER而表现出雌激素效应，也可以拮抗17β-雌二醇与ER的结合而表现出抗雌激素效应（Ghisari&Bonefeld-Jorgensen，2009）。因此，DEHP可能一方面通过改变脑内雌激素水平，另一方面通过改变神经细胞雌激素受体活性而干扰雌激素对脑发育的调节作用。
2.DEHP对脑形态结构发育的影响
DEHP的代谢产物MEHP可通过影响细胞增殖与分化而干扰神经细胞发育。在神经生长因子（NGF）诱导PCI2细胞系分化的进程中，MEHP（2.5-250μM）暴露4天可增加膜蛋白和细胞骨架蛋白的含量，促进NGF诱导的神经突起生长，上调胆碱乙酰基转移酶mRNA表达，却下调酪氨酸羟化酶mRNA的水平，显示出促进神经细胞从多巴胺（dobamine，DA）表型向乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）表型分化的现象（chen，Yang，Li，Chen，&Xu，2011）。
雌激素参与调节神经元树突棘和突触的发育过程以及神经回路的形成。胚胎时期大鼠脑皮层发育有三个重要阶段：E14，神经元细胞开始形成期；E18，胶质细胞开始形成期；E20，出生前脑发育稳定期。与成年个体相比，发育中的脑对环境刺激更加敏感，因为胚胎外胚层的一个小条带即可发育成含有上万个细胞并具精确组织形式的复杂器官，加之发育中的血脑屏障尚未完善，母体DEHP暴露可影响胎儿或新生儿的脑发育。受孕第8天的母体暴露于DEHP可导致大鼠胚胎神经管发育畸形，主要表现为脑膨出和露脑（蔡林强，2007）。在母体妊娠第8-17天和仔鼠出生后第3-7天暴露于1mg/kg/day DEHP可降低2周龄小鼠中脑多巴胺能神经元数目和6周龄小鼠的脑重（Tanida et al.，2009）。妊娠期和哺乳期DEHP暴露还可损伤子代雄性大鼠中枢神经系统的性别发育，这些仔鼠在生殖器官发育正常的情况下表现出生殖行为无能（Moore，Rudy，Lin，Ko，&Peterson，2001）。生后早期，大脑还要经历突触发生和重塑、髓鞘形成等重要过程。Smith，Macdonald和Holahan（2011）发现，在出生后第16-22天这一海马发育的敏感时期暴露于DEHP（10mg/kg）可降低雄性大鼠海马CA3区的轴突标记物水平，同时还减少齿状回（DG）和CA3区未成熟和成熟神经元的密度，但对雌性大鼠海马形态结构发育没有影响。这些结果显示，发育期DEHP暴露不仅影响脑形态发育和分化，还可影响成年后的大脑组织结构和功能。
3.DEHP对脑内递质系统和神经内分泌的影响
脑是神经活动的结构基础，而神经递质在脑功能活动中起信息传递的关键作用。脑内各递质系统的发育表现出时空变化，雌激素在这个过程中起重要的调节作用，而DEHP可干扰雌激素对脑内递质系统发育的调节。
3.1对下丘脑氨基酸递质和神经内分泌的影响
神经和内分泌是两个关系密切又互相影响的系统，在发育的性别分化过程中，下丘脑氨基酸递质系统对神经元分泌促性腺激素释放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）起重要的调节作用。兴奋性氨基酸天门冬氨酸（Asp）可刺激GnRH分泌，而抑制性氨基酸γ-氨基丁酸（GABA）则相反，并最终调节促性腺激素FSH的释放。围生期DEHP暴露可以通过下丘脑一垂体系统调节神经递质及相关激素水平而影响神经系统发育。妊娠期和哺乳期暴露于30mg/kg/dayDEHP在降低青春期雄性大鼠（30日龄）睾丸重量和血清FSH水平的同时，提高下丘脑GABA水平而降低Asp水平，因此抑制了氨基酸对促性腺激素的刺激效应（carbone et al.，2010）。而从妊娠始至生后15天DEHP暴露影响青春期前（15日龄）雌、雄仔鼠生殖相关的神经内分泌活动。与对青春期雄性大鼠的作用相反，DEHP降低了青春期前雄性仔鼠下丘脑GABA水平，却增加了Asp水平；而对青春期前雌性仔鼠下丘脑GABA和Asp水平均有增加作用，这些变化促进了氨基酸对青春期前雌、雄仔鼠促性腺激素的刺激效应（Carbone et al.，2012）。这一发现为DEHP对下丘脑氨基酸神经递质和神经内分泌的影响提供了新证据，同时也为DEHP生殖毒性机制的研究提供了新思路。 3.2对多巴胺递质系统的影响
脑内多巴胺（Dopamine，DA）递质系统参与中枢神经系统包括运动，认知、动机和奖赏、情绪和注意力等许多活动的调节。环境内分泌干扰物可影响多巴胺递质系统而改变神经行为。5日龄雄性大鼠脑室注射DEHP，在4-5周龄时出现明显的自发性多动症（motor hyperactivity），其夜间活动性增加1倍多；到8周龄时纹状体和中脑的多巴胺受体D1A基因和甘丙肽受体2基因表达降低，而多巴胺受体D2基因表达增加（Ishido，Morita，Oka，&Masuo，2005），表明DEHP可能抑制了多巴胺神经元的发育。为了研究环境内分泌干扰物引起多动症的机制，Masuo，Morita，Oka和Ishido（2004）比较了内分泌干扰物和6-羟多巴胺（6-OHDA）诱导的多动症模型的差异，发现6-OHDA诱导的4-5周龄大鼠夜间表现出严重的多动症，而内分泌干扰物（双酚A、壬基酚、DEHP）诱导的大鼠表现出更为严重的多动症症状，除了夜间，白天也表现出明显增多的自发活动。进一步分析发现，内分泌干扰物和6-OHDA诱导的多动症在纹状体和中脑的基因表达改变明显不同：DEHP改变了中脑编码G蛋白偶联受体的基因表达水平。这些结果表明，发育期6-OHDA与DEHP诱导成年大鼠多动症的机制不同，DEHP诱导大鼠多动症可能涉及与多巴胺神经转导以及许多肽能神经转导相关的G蛋白偶联受体基因表达水平的改变（Ishido et al.，2005）。
3.3对甲状腺激素分泌的影响
甲状腺激素（Thyroid hormone，TH）是调节机体尤其是大脑发育的重要激素，参与大脑成熟过程的多个基因均受TH的调节（Bernal，2005）。在胚胎至新生儿这一神经系统发育的关键时期，TH水平异常将导致不可逆转的精神发育迟滞和神经功能障碍。包括DEHP在内的PAE类增塑剂和酚类物质可影响TH依赖的大鼠脑垂体肿瘤细胞株GH3的增殖（Ghisari&Bonefeld-Jorgensen，2009）；DEHP暴露的大鼠甲状腺组织发生病理学改变，血浆中游离甲状腺素（T4）浓度降低（Botelho et al.，2009）；而大鼠静脉注射相当于输血过程中从PVC血袋浸出量水平的DEHP后，血清中T4和T3水平增加（王佳，董四君，2012）。可见DEHP可扰乱体内甲状腺组织活动，改变体内TH水平而影响脑的发育。
4.DEHP对神经细胞钙离子的影响
最近，应用电生理技术对DEHP在果蝇投射神经元突触前传递中作用的研究发现，DEHP（100μM）可影响果蝇触角叶投射神经元的自发电活动，降低自发性放电频率和微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）的频率和振幅，同时DEHP抑制了钙通道振幅的峰值（Ran，Cai，Wu，&Gu，2012）。这些结果提示DEHP可能通过抑制钙通道活动改变果蝇触角叶投射神经元突触前传递，同时也提示神经递质系统可能是DEHP作用的靶点。而Tully，Kuofer Dopico和Treistman（2000）首次报道了DEHP对神经组织钙离子动力学的急性效应。他们发现急性暴露于从静脉注射器溶出的含DEHP（～800nM）的混合液可导致大鼠神经末梢和嗜铬细胞瘤细胞（PC12）内钙离子水平增加。刘艳华等也发现围生期母体暴露于10-500mg/kg/dayDEHP的仔鼠出生后21天表现出海马神经元细胞内Ca2+升高，并且存在一定剂量效应关系（刘艳华等，2011）。细胞内钙在神经细胞活动中发挥重要作用，包括调节兴奋性、神经递质释放和细胞内信号蛋白活动。DEHP导致的神经元胞内钙离子浓度改变可能是神经发育毒性的一个重要机制。
5.DEHP对神经行为的影晌
神经行为是神经系统功能活动的最终体现，各种因素诱导的神经元形态结构、神经环路和递质系统等变化均有可能改变神经行为。因此，环境内分泌干扰物很容易因干扰脑内雌激素的活动而影响神经行为的发育。
从F0代小鼠5周龄始至F1代9周龄止，在食物中添加DEHP（7-70mg/kg/day）可影响F1代雌、雄小鼠的早期行为发育，表现为中低剂量DEHP延迟4日龄雌性仔鼠的翻正反射（surfacerighting reflex），中高剂量DEHP抑制7日龄雄性仔鼠的翻正反射（Tanaka，2002）。围生期DEHP暴露也有类似作用，从妊娠始至孕19天连续暴露于500 mg/kg/day DEHP的大鼠其所生仔鼠的负趋地性反射（negative geotaxis reflex）和空中翻正反射（air righting reflex）延迟（刘艳华等，2011）。此外，生后5天暴露于DEHP还会诱导青春期雄性大鼠的多动症，夜间活动性增加l倍以上（Ishido et al.，2005）。这些行为缺陷均表现出雄性大于雌性的现象。
学习记忆和情感是脑的高级神经功能。大鼠从妊娠日始至孕19天暴露于100-500 mg/kg/dayDEHP，将延长6周龄仔鼠在水迷宫中寻找平台的潜伏期（刘艳华等，2011），增加穿梭箱实验中遭电击次数并延长主动逃避电击的潜伏期（刘艳华等，2011；潘亮等，2012）。妊娠7-16天暴露于250、750、1000mg/kg/day DEHP明显增加断乳（21日龄）仔鼠在跳台实验中遭电击后跳下平台的错误次数，缩短遭电击后的步下潜伏期，缩短在避暗实验中遭电击后的步入潜伏期（张晶莹，宋昕恬，孟令仪，2012）。但在断乳后暴露于10-1000mg/kg/day DEHP两周对雄性大鼠水迷宫的空间学习记忆没有影响（逯晓波等，2008）。这些研究表明，DEHP影响包括空间记忆、被动回避和主动回避等多种学习记忆行为；而围生期DEHP暴露对学习记忆的影响更显著，不仅影响子代幼年时的学习记忆行为还可影响动物成年后的远期学习记忆功能。此外，DEHP还影响动物的情感活动。初断乳雄性小鼠暴露于5-500mg/kg/day DEHP10天后，与正常对照组相比，强迫游泳实验中静止不动的时间明显延长，表明DEHP可诱发幼年小鼠的抑郁样行为（周佩等，2012）。
目前，有关DEHP暴露对人类神经行为影响的研究十分有限。Yolton，Xu，Strauss，Altaye，Calafat和Khoury（2011）测定了美国350名孕妇在怀孕16周和26周时尿液中双酚A和PAEs含量，并与其所产婴儿在5周岁之前的健康状况进行比对。结果发现，PAEs与婴儿的神经行为有关联，作用效果取决于PAEs的类型，尿液中较高水平的DEHP影响26周男婴的反射功能。基于人群的流行病学研究结果表明，尿液中DEHP代谢产物MEHP的浓度与儿童的行为相关（Engel et al.，2009）。学龄儿童尿液中PAEs代谢物含量与其智商成反比（Cho et al.，2010），与注意缺陷多动症（attention deficit hyperactivi哆disorder）呈正相关关系（Kim et al.，2009），而DEHP诱导青年大鼠多动症的发现为此提供了证据（Ishido et al.，2005）。
6.结语
由于PAEs增塑剂的广泛使用，DEHP已成为环境中普遍存在的持久性有机污染物，人类和动物可经多种途径终生暴露于DEHP。尽管其毒性较低，且进入体内后大多可被代谢，但越来越多的研究表明，DEHP对人和动物的多个系统及其发育存在潜在的危害。目前，大多数DEHP毒性研究主要集中在生殖发育毒性的动物实验，而根据以上这些来自实验动物和人类的研究结果可以推测DEHP可能影响人类大脑的发育，但目前人们对这方面的认识还很缺乏。因此，今后可在DEHP影响脑和行为发育的机制和人群流行病学方面开展研究，为DEHP的毒性防治和今后DEHP环境排放新标准的制定提供科学依据。
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