水翁花黄酮DMC诱导肝癌细胞SMMC―7721凋亡的机制研究

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　　[摘要] 目的：研究水翁花黄酮类化合物2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）体外诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡作用及其分子机制。方法：采用改进的Sellins-Cohen方法检测不同浓度的DMC对SMMC-7721细胞DNA片段化的影响。用PCR-ELISA法测定肿瘤细胞的端粒酶活性，用半定量RT-PCR法测定c-myc和人端粒酶逆转录酶（hTERT）的mRNA表达量，Western blot法检测c-myc及hTERT蛋白的表达。结果：DMC作用于人肝癌SMMC-7721细胞后，引起SMMC-7721细胞DNA片段化率增大，片段化率效果有明显的浓度依赖性。与对照组相比，20 μmol・L-1DMC处理48 h后，肝癌细胞的端粒酶活性下降了（66.2±2.1）%。c-myc和hTERT 的mRNA表达水平分别下降了（67.3±2.1）%，（64.4±2.3）%，c-myc和hTERT 的蛋白表达水平分别下降了（69.6±1.9）%，（71.3±2.4）%。结论：DMC能诱导SMMC-7721细胞凋亡，其凋亡机制可能与c-myc基因和hTERT的mRNA以及蛋白的表达降低有关。
　　[关键词] 水翁花；凋亡；黄酮；肿瘤；端粒酶
　　[收稿日期] 2013-12-03
　　[基金项目] 浙江省自然科学基金项目（LY12C02002）
　　[通信作者] 叶春林，副教授，博士，主要从事天然产物的提取工艺及其生物活性的研究，Tel： （0571） 85070370，E-mail： chlye2005@126.com
　　水翁花为桃金娘科植物水翁Cleistocalyx operculatus（Roxb.） Merr. et Perry的干燥花蕾，具有清热解毒，消食化滞的功效[1]，在民间使用非常广泛，也是“清热凉茶”中成药的主要原料。有研究报道，在小鼠心脏灌注系统中，水翁花提取物通过抑制Na+/K+-ATPase的活性加强了心脏的收缩功能，同时降低了心脏的收缩频率，因而推断水翁花中可能含有强心成分[2]。作者在前期的实验中，从水翁花中分离提取出了5个黄酮类化合物[3]，其中的主要成分为2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）。抗肿瘤活性实验表明，DMC对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖具有很强的抑制作用，Hoechst荧光染色、流式细胞术检测细胞亚G1峰结果说明DMC能够诱导SMMC-7721细胞凋亡[4]。但其具体作用机制尚不十分清楚。本实验通过考察DMC对人肝癌SMMC-7721细胞DNA片段化、端粒酶活性以及c-myc和人端粒酶逆转录酶（hTERT）的mRNA以及蛋白表达水平的影响，研究其对人肝癌细胞的凋亡作用及机制，为深入开发水翁花黄酮类化合物在抗肿瘤方面的潜力提供一定的实验和理论依据。
　　1 材料
　　1.1 药物、试剂与仪器 2′，4′-二羟基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮（DMC）晶体（纯度>98%）由本实验室制备获得[3]，临用时以少量DMSO溶解，再加培养液稀释至所需浓度，其中DMSO的终浓度<0.01%；Trizol试剂，RPMI 1640培养基购自美国Life Technologies公司；小牛血清购自杭州四季青生物技术有限公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自上海生工工程有限公司；端粒酶活性测定试剂盒购自德国Roche公司。山羊源的抗action蛋白质抗体、鼠源的抗c-myc蛋白质抗体、兔源的抗hTERT蛋白质抗体购于美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊、山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；ECL-Western印迹检测试剂盒购自英国Amersham Pharmacia Biotech公司。XD202倒置显微镜购自南京江南永新光学有限公司；MK3酶联免疫检测仪购自美国Thermo公司；BB15 CO2培养箱购自德国Heraeus公司。
　　1.2 细胞株及细胞培养 人肝癌细胞SMMC-7721购于中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。用含10%小牛血清、100 U・mL-1青霉素和100 mg・L-1链霉素的RPMI 1640培养液，置于37 ℃恒温，5%CO2及饱和湿度的培养箱培养，每2～3 d传代1次。
　　2 方法
　　2.1 DNA片断化检测 参考Sellins-Cohen法进行DNA片段化分析，并做适当的改进[5-7]。用0～20 μmol・L-1梯度浓度的DMC作用SMMC-7721细胞48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化离心，以PBS清洗2遍，1 000 r・min-1离心，收集细胞。用细胞裂解液（10 mmol・L-1 Tris，1 mmol・L-1EDTA，0.2% Triton X-100，pH 7.5）裂解细胞，离心（13 000×g，10 min），分离上清液和沉淀。将上清液和沉淀分别在4 ℃，12.5%三氯乙酸（TCA）中进行沉淀，将上述沉淀分别用5%三氯乙酸在90 ℃水解20 min后，用二苯胺试剂进行定量分析。DNA 片段化率以每份样品上清液中DNA的含量占总DNA含量的百分比来计算。
　　2.2 端粒酶活性测定 采用TRAP-ELISA法检测肝癌细胞株SMMC-7721端粒酶活性。用0～20 μmol・L-1梯度浓度的DMC处理SMMC-7721细胞48 h后，细胞消化离心，收集细胞。将细胞制备端粒酶提取液，经过逆转录、端粒酶灭活、PCR扩增和ELISA检测后，用酶标仪在450 nm，参考波长为690 nm下测定吸光度。具体方法可参照端粒酶活性测定试剂盒说明书以及文献进行[8-9]。 　　2.3 RT-PCR检测相关基因表达 采用不同浓度的DMC（5，10，20 μmol・L-1）处理SMMC-7721细胞48 h后，细胞消化离心，收集各组细胞，用Trizol法提取细胞总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，测样品A260/A280后，做RT-PCR。按照两步法试剂盒的操作步骤分别进行逆转录反应和多聚酶链反应。cDNA 的合成参照逆转录扩增试剂盒操作程序进行。c-myc扩增条件为： 94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，33个循环；72 ℃ 5 min。hTERT扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。β-actin扩增条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，33个循环；72 ℃ 5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后通过凝胶成像系统分析结果，以c-myc和hTERT的RNA条带与β-actin的RNA条带单位面积内的灰度比值表示c-myc和hTERT的RNA的相对表达水平。
　　RNA的抑制率=（1-实验组的RNA的相对表达水平/对照组的RNA的相对表达水平）×100%
　　引物由上海生工工程有限公司合成，引物序列见表1。
　　2.4 Western blot法检测相关蛋白表达 将0～20 μmol・L-1梯度浓度的DMC作用SMMC-7721细胞48 h后，消化离心，收集细胞，PBS洗涤，加细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，超声破碎后，用Bradford比色法测蛋白浓度。蛋白煮沸5～10 min，SDS-PAGE凝胶电泳分离总蛋白，上样量为40 μg，将蛋白通过电转移印迹转至PVDF膜上，脱脂牛奶封闭2 h，一抗4 ℃过夜，TBST洗涤3次，每次10 min，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10 min。加入ECL试剂发光，于暗室中曝光X胶片，以c-myc和hTERT蛋白条带与β-actin蛋白条带单位面积内的灰度比值表示c-myc和hTERT蛋白的相对表达水平。
　　蛋白的抑制率=（1-实验组蛋白的相对表达水平/对照组蛋白的相对表达水平）×100%
　　2.5 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，数据均以±s表示。多组计量资料采用单因素方差分析，组内两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　3 结果
　　3.1 DMC诱导SMMC-7721细胞凋亡的作用 与对照组相比，各样品处理组SMMC-7721细胞的DNA片段化率均升高（P<0.05），且与剂量相关。相比对照组，SMMC-7721细胞经过5，10，20 μmol・L-1DMC作用48 h后，DNA片段化率分别为（8.3±0.9）%，（20.7±1.1）%，（38.2±1.3）%。
　　3.2 对肝癌细胞端粒酶活性的影响 DMC可抑制SMMC-7721肝癌细胞的端粒酶活性，并且与药物浓度密切相关。SMMC-7721细胞经20 μmol・L-1的DMC处理48 h后，肝癌细胞的端粒酶活性下降了（66.2±2.1）%，见图1。
　　3.3 DMC对SMMC-7721细胞中c-myc和hTERT的mRNA表达水平的影响 与对照组相比，各样品处理组SMMC-7721细胞的c-myc和hTERT 的mRNA表达水平均降低，并随药物浓度增大抑制作用增强。与对照组相比，SMMC-7721细胞经20 μmol・L-1的DMC处理48 h后，c-myc和hTERT 的mRNA表达水平分别下降了（67.3±2.1）%，（64.4±2.3）%。说明DMC对SMMC-7721细胞c-myc和hTERT的mRNA表达量有明显抑制作用，见图2。
　　3.4 DMC对SMMC-7721细胞中c-myc和hTERT蛋白表达水平的影响 与对照组比较，肝癌细胞中的c-myc和hTERT 的蛋白表达水平均降低，并呈现剂量依赖关系，这一结果与DMC对SMMC-7721中c-myc和hTERT的mRNA表达量的影响结果相一致。与对照组相比，用20 μmol・L-1的DMC处理SMMC-7721细胞48 h后，c-myc和hTERT 的蛋白表达水平分别下降了（69.6±1.9）%，（71.3±2.4）%。说明DMC对SMMC-7721细胞c-myc和hTERT的蛋白表达量同样具有明显的抑制作用，见图3。
　　4 讨论
　　诱导细胞凋亡是抗肿瘤药物作用的一个重要机制。凋亡具有不同形态学特征性变化，包括细胞核的变化，细胞质的变化，DNA断裂，磷脂酰丝氨酸外翻，细胞膜出泡形成凋亡小体等[10-11]。作者前期研究工作证实，DMC具有显著的抗肿瘤作用，Hoechst荧光染色、流式细胞术检测细胞亚G1峰结果说明DMC能够诱导SMMC-7721细胞凋亡[4]。本研究结果显示，DMC能导致SMMC-7721细胞DNA片段化，且表现出浓度依赖性，进一步确证了DMC对SMMC-7721肝癌细胞的凋亡作用。
　　端粒酶是一个反转录酶，它能够以自身为模板合成端粒，使染色体两端的端粒不缩短，避免染色体两端融合，使细胞无限繁殖。肿瘤细胞端粒酶活性增强是肿瘤细胞永生化的原因之一[12]。本研究还显示DMC在诱导SMMC-7721凋亡的同时，端粒酶活性受抑制， 且呈剂量依赖性。文献报道hTERT是端粒酶的催化亚单位，与端粒酶的活性密切相关[13]，并且在许多肿瘤细胞中c-myc表达与hTERT的表达水平相平行，c-myc可能通过激活hTERT的表达而导致肿瘤发生[14-15]。本研究的RT-PCR以及Western blot结果提示，DMC能够降低SMMC-7721细胞c-myc基因和hTERT的mRNA以及蛋白的表达量。10 μmol・L-1的DMC就能明显地抑制SMMC-7721细胞c-myc基因和hTERT的mRNA和蛋白的表达水平。随着DMC作用浓度的增加，这种抑制效果更加显著。 　　综上所述，本研究结果提示，DMC可能通过降低SMMC-7721肝癌细胞c-myc基因的mRNA和蛋白的表达量，从而抑制了hTERT的mRNA和蛋白的表达水平，并进一步抑制端粒酶活性，最终导致SMMC-7721肿瘤细胞的凋亡。但DMC影响c-myc基因表达量的具体机制则有待进一步研究。
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　　Study on mechanism of inducing apoptosis in human hepatoma SMMC-7721 　　cells by DMC， a chalcone from buds of Cleistocalyx operculatus
　　YE Chun-lin， LAI Yi-feng， LIU Xuan-gan， HUANG Qi
　　（School of Biological and Chemical Engineering， Zhejiang University of Science and Technology， Hangzhou 310023， China）
　　[Abstract] Objective： To study the in-vitro inducing apoptosis mechanism of human hepatoma SMMC-7721 cells by 2′，4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′，5′-dimethylchalcone （DMC）， a chalcone compound from Cleistocalyx operculatus. Method： Quantitative DNA fragmentation assay was carried out to detect the effect of DMC of different concentrations on SMMC-7721 cells，according to the method of Sellins and Cohen with some modifications. Telomerase activities of the cells were determined by PCR-ELISA methods. The expression quantity of c-myc and hTERT mRNA were determined by semi-quantitative RT-PCR. The effect of DMC on expression levels of cmyc and hTERT protein were measured by western blot. Result： The percentage of DNA fragmentation increased with notable concentration dependence， after treatment with DMC for 48 h. Compared with that of control group， the telomerase activity of the cells decreased by （66.2±2.1）% after 48 h treatment with 20 μmol・L-1 DMC， the mRNA expression of c-myc and hTERT decreased by （67.3±2.1）% and （64.4±2.3）%， respectively， and the protein expression of c-myc and hTERT decreased by （69.6±1.9）% and （71.3±2.4）%， respectively. Conclusion： DMC can induce SMMC-7721 cell apoptosis and the apoptosis mechanism may be related to the decreased mRNA and protein expression of c-myc and hTERT.
　　[Key words] Cleistocalyx operculatus； apoptosis； flavonoids； tumor； telomerase
　　doi：10.4268/cjcmm20141528
　　[责任编辑 张宁宁]
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