通腑汤对结肠吻合术后大鼠小肠推进率及结肠组织中NO含量、iNOS活性的影响
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[关键词]通腑汤;结肠吻合术后;大鼠小肠推进率;结肠组织;NO含量;iNOS活性
DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.05.090
术后胃肠功能障碍（postoperative gastrointestinal disorder，PGD）是胃肠动力出现障碍的一种以非机械性梗阻为特征、胃肠排空障碍为主要表现的胃肠动力紊乱综合征。胃肠神经功能平衡失调是其机制之一，胃肠电活动减弱，平滑肌细胞收缩受到抑制，胃肠平滑肌处于舒张的相对静止状态，进而产生腹胀、肠鸣音减弱或排便困难等，可进一步发展为早期术后肠梗阻[1]。一氧化氮（nitric oxide，NO）是由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸产生的气体信号分子。NO作为非胆碱能非肾上腺神经递质，在维持胃肠道正常运动中发挥重要作用。最近研究发现，NO浓度的大小影响胃肠功能，与多种胃肠道疾病关系紧密，因此胃肠组织NO的含量可能是PGD发病的重要机制，因此该研究方向成为关注热点。临床上对PGD多以对症治疗，缓解症状为主，采用改善胃肠道微循环、维持胃肠道生态平衡等治疗，虽然.针对性强，但措施单一、治疗局限[2]。中医治疗PGD具有整体观念和辨证论治的特色，从宏观的角度多靶点、多途径防治，临床疗效确切。通腑汤是北京中医药大学第一附属医院李乃卿教授多年治疗PGD的经验方。“理气通腑，养血和血”是其治疗原则，临床疗效显著。前期研究证实，通腑汤可以提高肠肌电活动、改善肠管收缩等途径改善胃肠功能，发挥治疗作用，但未从气体信号分子层面进行研究，本实验通过研究通腑汤对结肠吻合术模型大鼠小肠推进率及结肠组织NO含量的影响，从气体信号分子调节角度探讨通腑汤治疗术后胃肠功能紊乱的作用与机制。现报告如下。
1材料与方法
1.1材料购买SPF级SD大鼠30只，雄性，8周龄，体重200-250g，适应性喂养1周后，禁食水12h，按完全随机法分对照组和通腑汤组，每组15只。
1.2药物制备通腑汤药物组成：大黄10g、枳实15g、厚朴15g、芒硝10g、川棟子6g、炒莱菔子12g、木香6g、乌药10g、陈皮10g、半夏10g、当归10g、白芍12g，制备成含生药量4.5g/kg的药液。由北京中医药大学制备。所用中药均由北京康仁堂药业有限公司提供的中药配方颗粒。符合2015年版<中国药典>的相关要求。中药用量参照<中药药理学实验方法学>按实验动物与人用药量折算表计算，通腑汤中剂量给药量为4.5g/kg。
1.3动物模型按照0.33ml/100g称重，计算出各大鼠所需10%水合氯醛麻醉药物剂量，于右下腹腔注射麻醉;检查大鼠麻醉满意后，将大鼠仰卧固定于手术板上，将下腹部暴露，不需提前剪毛，用组织剪在大鼠中下腹正中剪开长约2cm切口，找到盲肠下2cm处结肠，剪断后原位一层缝合法缝合，腹膜和肌层连续缝合，间断缝合皮层。术后大鼠背部皮下注射2万IU/kg青霉素G钠和250mg/kg硫酸链霉素，连续3d;术后48h内禁食不禁水，早晚分别灌胃20%葡萄糖溶液2次，间隔8h，第3天灌胃饲料糊20ml/kg（标准饲料超微粉碎，配制20%饲料糊），第4天自由饮食。
1.4实验方法术后6h开始干预，通腑汤组大鼠以4.5gkg剂量灌胃，灌服药物剂量根据实验动物与人相同体表面积折算，即200g大鼠所需剂量相当于成人量（70kg）x0.018，然后通腑汤组大鼠予通腑汤4.5ml/kg灌胃治疗，对照组给予等体积温水4.5ml/kg灌胃，1次/d，连续7d。末次给药后24h，实验大鼠均用碳素墨水按1ml/只的剂量灌胃，30min后处死。.1.5标本采集取大鼠结肠手术部位组织，冰冻0.9%氯化钠（NaCI）溶液漂洗。用滤纸快速吸干，按重量（g）：体积（m）为1：9的比例加0.9%NaCl溶液制成10%的组织匀浆液，低温3000r/min離心15min，取上清液置于-209待测。
1.6检测指标
1.6.1小肠推进率测定小肠推进率=幽门至碳末前端的距离+小肠全长x100%。操作：将幽门至回盲部的小肠，放人测量容器中，测量墨水在肠管内的移动的距离和小肠全长。
1.6.2结肠组织NO含量测定NO含量（umol/g）=[（测定管吸光度一空白管吸光度）+（标准管吸光度一空白管吸光度）]x标准品浓度（20umol/g）x样本的蛋白含量（g/L）。操作：依据试剂盒配制标准品说明，测定管内滴加样本、相关试剂，于37C水浴60min，再加入滴试剂混匀离心，取上清加显色剂，在调至550nm波长的多功能酶标仪上进行比色。
1.6.3结肠组织诱导型一氧化氮合酶iNOS活性测定NOS活力（U/mg）=[（测定管吸光度一空白管吸光度）/呈色物纳摩尔消光系数]x（反应液总体积/取样量）+（比色光径x反应时间）+蛋白含量（mg/L）。操作：依据试剂盒说明书，将试剂加人测定管混匀，于37C水浴15min，再加透明剂、终止液混匀，蒸馏水调零，在530nm波长处测定各管的吸光度OD值。
1.7统计学方法采用SPSS16.0统计学软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，作方差齐性和正态性检验，满足方差齐性以one-way ANOVA法进行方差分析，不满足方差齐性则以非参数法检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1两组大鼠小肠推进率比较通腑汤组大鼠的小肠推进率为（76.28±5.60）%，显著高于对照组的（59.32±7.54）%，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1，图1。
2.2两组大鼠结肠组织NO含量比较通腑汤组大鼠的结肠组织NO含量（5.30±1.12）umol/g明显低于对照组的（18.34±2.11）umol/g，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2，图2。 2.3两组大鼠结肠组织iNOs活性比较通腑汤组大鼠的结肠组织iNOs活性（10.55±1.41）umol/g明显低于对照组的（19.56±4.32）umol/g，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表3，图3。
3讨论
肠神经系统（enterie nervous system，ENS）是调节胃肠运动，使消化系统功能正常运行的三大神经系统之一。NO在胃肠道分布广泛，是NOS的产物，是ENS主要的非肾上腺素能非胆碱能神经递质。通过非传统接头后功能受体活化可溶性鸟苷酸环化酶（sGC），然后将三磷酸鸟苷（GTP）分解生成环磷酸鸟苷（cGMP），激活蛋白激酶G，降低Ca2+敏感性和激活K*通道[3]，进而发挥抑制性神经递质的作用，抑制胃肠动力，延缓胃排空。然而NO具有细胞保护和细胞毒性的双重效应。生理条件下，NO作为一种内源性介质调节组织的修复及其完整性。由于NO没有专门的储存及释放调节机制，靶细胞上NO的多少直接与NO的生成量有关。iNOS是产生NO的主要合成酶，生理条件下iNoS并不表达，在应激和炎性反应情况下，巨噬细胞和肠平滑肌细胞生成大量的iNOS[4]，產生高浓度NO，并与超氧阴离子结合成亚硝酸阴离子，并质子化形成具有强氧化性的过氧亚硝酸，蜕变为自由基，通过自由基链式反应导致含巯基蛋白和脂质过氧化，造成组织细胞损伤。因此，胃肠道的许多病理过程与高浓度的NO有关[5]。
中医对PGD的辩证分型目前尚未统一。李乃卿教授认为腹部手术扰乱了体内正常的气机运行，损耗胃肠气血，肝气失于疏泄，脾胃失于运化，腑气壅塞不畅而发病。气血亏虚为本，气滞血瘀、腑气不通为标。确立了“理气通腑，养血和血”的治疗原则。创立有独特疗效的经验方一通腑汤[6]。
本实验通过对大鼠行结肠吻合术，引起大鼠结肠组织中NO含量和iNOS活性升高，造成大鼠胃肠功能减弱，胃肠排空障碍。观察术后尽早给与大鼠通腑汤灌胃对小肠推进率及结肠组织中NO含量和iNOS活性的影响。研究表明，与对照组相比通腑汤组大鼠小肠推进率显著增大，结肠组织中NO含量及iNOS活性明显升高。
综上所述，通腑汤通过抑制iNOS活性，减少NO产生和释放发挥重要作用，从而促进胃肠蠕动，治疗术后胃肠功能紊乱。
参考文献
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[收稿日期：2019-09-29]
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