联合检测Survivin与Egr-1在食管鳞癌中的表达及临床意义

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　　[摘要] 目的 探討Survivin和Egr-1在食管鳞癌组织和正常食管组织中的表达情况，分析Survivin和Egr-1与食管鳞癌临床病理特征和预后的相关性。方法 采用免疫组织化学染色方法检测2012年1月—2014年6月方便收集的80例食管鳞癌组织和20例正常食管组织中Survivin和Egr-1的蛋白表达水平，统计分析Survivin和Egr-1与临床病理特征和生存预后之间的关系。结果 Survivin在食管鳞癌组织中阳性表达率为68.8%（55/80），高于在正常组织中的阳性表达率5.0%（1/20）（χ2=26.39，P<0.05）。Egr-1在食管鳞癌中的低表达率为66.3%（53/80），高于正常组织中的15.0%（3/20）（χ2=17.06，P<0.05）。Survivin蛋白在食管鳞癌中阳性高表达与患者的性别、年龄以及肿瘤的分化程度，差异无统计学意义（P>0.05），与食管鳞癌患者TNM分期、肿瘤的浸润深度、肿瘤大小以及淋巴结是否转移，差异有统计学意义（P<0.05）。Egr-1蛋白在食管鳞癌中阳性低表达与患者性别、肿瘤大小以及肿瘤浸润深度，差异无统计学意义（P>0.05），与食管鳞癌患者年龄、TNM分期、肿瘤分化程度以及淋巴结是否转移，差异有统计学意义（P<0.05）。随访结果显示食管鳞癌患者5年生存率为48.9%，中位生存时间为53.1个月。结论 Survivin和Egr-1在食管鳞癌的发生发展中起重要作用，联合检测两者对判断食管鳞癌的预后有一定的指导意义，Survivin和Egr-1有望作为食管鳞癌的治疗或者预后预测靶标。
　　[关键词] Survivin;Egr-1;食管鳞癌;免疫组化
　　[Abstract] Objective To investigate the expression of Survivin and Egr-1 in esophageal squamous cell carcinoma tissues and normal esophageal tissues， and to analyze the correlation between Survivin and Egr-1 and the clinicopathological characteristics and prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. Methods The expression levels of Survivin and Egr-1 in 80 esophageal squamous cell carcinoma tissues and 20 normal esophageal tissues conveniently collected from January 2012 to June 2014 were detected by immunohistochemical staining. Survivin and Egr-1 were statistically analyzed. Relationship with clinicopathological characteristics and survival prognosis. Results The positive expression rate of Survivin in esophageal squamous cell carcinoma was 68.8% （55/80）， which was higher than that in normal tissues 5.0%/（1/20）（χ2=26.39， P<0.05）. The low expression rate of Egr-1 in esophageal squamous cell carcinoma was 66.3% （53/80）， which was higher than 15.0% （3/20） in normal tissues（χ2=17.06， P<0.05）. The positive expression of Survivin protein in esophageal squamous cell carcinoma was not significantly different from the patient's gender， age， and tumor differentiation（P>0.05）. It was different from TNM staging， tumor invasion depth， tumor size， and lymph nodes in patients with esophageal squamous cell carcinoma. The difference was statistically significant（P<0.05）. There was no statistically significant difference between the positive expression of Egr-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma and the patient's gender， tumor size， and depth of tumor invasion（P>0.05）. It was different from the age， TNM stage， tumor differentiation， and lymph nodes of patients with esophageal squamous cell carcinoma. The difference was statistically significant（P<0.05）. The follow-up results showed that the 5-year survival rate of patients with esophageal squamous cell carcinoma was 48.9%， and the median survival time was 53.1 months. Conclusion Survivin and Egr-1 play an important role in the occurrence and development of esophageal squamous cell carcinoma. The combined detection of both has certain guiding significance for judging the prognosis of esophageal squamous cell carcinoma. Survivin and egr-1 are expected to be therapeutic or prognostic targets for esophageal squamous cell carcinoma. 　　[Key words] Survivin; Egr-1; Esophageal squamous cell carcinoma; Immunohistochemistry
　　食管癌是原发于食管黏膜上皮的恶性肿瘤，严重威胁人民健康。以2018年为例，全球新增食管癌病例约455 800例，其中50%以上发生在中国[1]，而我国食管癌占全世界所有食管癌的90%～95%[2-3]，主要是食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）。近年来我们在ESCC的治疗方面取得了较多进展，但晚期ESCC的预后仍不容乐观，5年生存率不超过30%，究其原因仍旧是是缺乏有效的早诊手段，患者在接受诊治时已经是晚期，错过最佳治疗时机。ESCC的早发现早诊断是临床改善患者预后的有效的方法，因此寻找食管癌诊疗和预后判断的有效指标是目前亟待解决的问题。
　　Survivin是迄今为止发现的最强的凋亡抑制因子[4]，其能通过结合凋亡效应蛋白Caspase-9并阻止其活化而实现，Survivin还能直接抑制凋亡效应蛋白Caspase-3/7，继而发挥抗凋亡作用[5-6]。Survivin在生理状态下仅在胚胎中表达，在成人已分化的组织中不表达或低表达，但在病理状态下广泛高表达于人食管癌、结直肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤组织中[7-8]。研究表明，Survivin在食管癌中高表达[7]，并且Survivin是食管癌患者独立的预后因素[9-10]。
　　早期生长应答蛋白-1（early growth responsive protein-1， Egr-1）属于转录因子锌指蛋白家族成员，是一类早期生长反应基因[11]。Egr-1能够在较短时间内激活下游信号通路，其活性也可在较短时间内衰退。Egr-1能够通过参与多种信号通路来调节细胞生长、分化和凋亡等[12]。目前尚无研究报道ESCC组织中Egr-1的表达。该研究拟通过免疫组化联合检测2012年1月—2014年6月收集的80例食管鳞癌和20例正常食管组织中Survivin和Egr-1蛋白的表达情况，通过分析其与ESCC性别、年龄、肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移和预后的关系，探讨两者在食管癌发生、发展中的作用与意义，以期为ESCC的早期诊断和临床治疗提供新的依据。现报道如下。
　　1  样本与方法
　　1.1  样本
　　样本来源为方便选取新疆医科大学附属肿瘤医院进行食管癌手术的80例病例，病例包括完整的临床信息，术前均未进行放疗、化疗等治疗。临床资料如下：男性52例，女性28例;平均年龄（58±6.8）岁。ESCC诊断参照国际抗癌联盟TNM分期标准，其中I期22例，II期31例，III期27例;淋巴結转移21例，无淋巴结转移59例。对照组选择20例手术中留取的ESCC远端正常组织标本（距癌组织≥5 cm），经病理证实是正常食管鳞状上皮。该研究经医院伦理委员会批准。
　　1.2  试剂
　　兔抗人Survivin单克隆抗体重组Anti-Survivin抗体[EP2880Y] （ab76424）和鼠抗人单克隆抗体Anti-Egr1抗体[mAbcam55160] （ab55160）均购自美国Abcam公司，浓缩DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物有限公司。
　　1.3  方法
　　将石蜡包埋的组织标本依次放置于切片机上，制成厚度为5 μm边缘整齐的组织切片各3～5张。操作步骤如下：①烤片，将切片置于60 ℃恒温箱中，烘烤90 min;②脱蜡，烘烤后的切片置于二甲苯中15 min，待肉眼观切片呈透明状;③水化，依次将切片置于不同浓度梯度的乙醇中各5 min;④抗原修复，加入适量的0.1 M枸橼酸盐缓冲液，高温待缓冲液沸腾，缓慢将切片置于缓冲液中，后待切片自然冷却;⑤封闭，将切片置于2% BSA中，37 ℃ 2 h;⑥孵育一抗，向切片中组织所在部位滴加稀释后的一抗 （稀释倍数Survivin 1/200，Egr-1 1/250 ）;⑦孵育二抗：向切片中组织所在部位滴加适量二抗，37 ℃ 1 h;⑧清洗，将切片置于PBS中清洗;⑨染色，将切片置于DAB中5 min，苏木素中2 min;⑩分色，盐酸-乙醇中分色30 s;{11}脱水，依次将切片置于不同浓度梯度乙醇中各5 min;{12}透明，将切片置于二甲苯中5 min;{13}封片，向切片组织部位滴加少量的中性树胶，轻轻盖上盖玻片，风干。
　　1.4  判读结果
　　封好的切片使用Aperio病理工作站进行扫描，分析采用ImageScope软件。
　　Survivin 蛋白染色阳性结果：组织切片中细胞质呈现黄色或棕黄色染色为阳性细胞，阳性细胞占切片中全部肿瘤细胞的百分比 >10%;Egr-1蛋白染色阳性结果：主要存在于细胞核，棕色颗粒显色位于细胞核为阳性。染色结果根据细胞核着色的深浅以及着色的范围等条件进行综合判定。
　　免疫组化的结果评分标准：根据细胞着色的强弱分为0～3分，0分代表阴性，1分代表弱阳性，2分代表中等阳性，3分代表强阳性。根据细胞着色的百分比分为1～4分，10%代表1分，11%～50%代表2分，51%～80%代表3分，大于80%代表4分。将染色强度×阳性细胞百分比对应的值作为评分。
　　1.5  随访
　　对80例ESCC患者进行定期随访：手术后第1年，每3个月随访1次;术后第2年，每4～6个月随访1次。截至2019年6月。若患者失访或者死亡，则视为随访终止。
　　1.6  统计方法
　　所有数据均采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。以率（%）表示Survivin和Egr-1蛋白阳性表达、性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期和淋巴结是否转移等计数资料，比较采用χ2检验。 ESCC患者5年生存率采用Kaplan-Meier分析Survivin和Egr-1蛋白表达情况对ESCC患者预后的影响。P<0.05为差异有统计学意义。 　　2  结果
　　2.1  Survivin蛋白在ESCC组织和食管正常组织中的表达
　　Survivn蛋白阳性表达率在80例ESCC组织、20例正常食管组织的石蜡切片中分别为68.8%（55/80）和5.0%（1/20），ESCC与正常食管组织表达差异有统计学意义（P<0.05），见表1。
　　2.2  Egr-1蛋白在ESCC组织及正常组织中的表达
　　Egr-1蛋白在80例ESCC组织、20例正常食管组织的石蜡切片中均表达，Egr-1在ESCC组织和正常食管组织中的低表达率分别为66.3%（53/80）和15.0%（3/20），差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
　　2.3  Survivin在ESCC组织中的表达与临床病理的关系
　　Survivin蛋白阳性高表达与ESCC患者性别、年龄以及肿瘤分化程度均不具有相关性（P>0.05），与患者临床TNM分期、肿瘤浸润深度、肿瘤大小以及淋巴结是否转移具有显著相关性（P<0.05），见表3。
　　2.4  Egr-1在ESCC组织中的表达与临床病理的关系
　　Egr-1蛋白阳性低表达与ESCC患者性别、肿瘤大小以及肿瘤浸润深度无显著相关性（P>0.05），与年龄、TNM分期、肿瘤分化程度和淋巴结是否转移显著相关（P<0.05），见表4。
　　2.5  Survivin和Egr-1与ESCC患者预后的关系
　　随访80例ESCC患者60个月，中位随访时间为52个月，接受随访的80例ESCC患者，5年总生存率为48.9%，中位生存时间为53.1个月。
　　通过分析Kaplan-Merier生存曲线结果，Survivin蛋白阳性表达的ESCC患者的5年生存率低于Survivin蛋白阴性表达的ESCC患者（χ2=4.883，P<0.05）。Survivin蛋白阳性表达且Egr-1蛋白低表达组的ESCC患者5年生存率与Survivin蛋白阴性表达且Egr-1蛋白高表达组的ESCC患者5年生存率相比，差异有统计学意义（χ2=12.24，P<0.05）。
　　3  讨论
　　ESCC是我国较为常见的一种消化道恶性肿瘤疾病，随着社会经济的逐步发展，我国人民饮食结构、生活习惯、医疗水平和就诊意识的提升，ESCC的发病率和病死率呈现逐年下降趋势，但仍处于较高水平[13]，对患者的生活质量、生命安全造成极大的威胁和沉重的经济负担。ESCC早期发现、早期诊断、早期治疗是改善预后最有效的方法。研究表明[14]，ESCC的发生和发展过程是多种基因共同参与、多个阶段演化而成的复杂过程，原癌基因激活和抑癌基因失活为参与细胞周期、凋亡等的异常细胞提供了生存的机会，导致机体ESCC的发生和发展。
　　Survivin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of a apoptosis protein，IAPs）家族中最强的凋亡抑制因子，其在人类多种恶性肿瘤中广泛表达，参与多种信号通路的调节。Survivin基因位于人类17号染色体q25带上，全长14.7 kb，由3个内含子和4个外显子组成。Survivin蛋白由142个氨基酸组成，相对分子质量为16 500，其N末端区域从第15～87位氨基酸残形成了3个反向平行β折叠和4个α螺旋的空间结构，这是一个单独的BIR结构域，该结构域是IAP家族的标志[15]。Survivin在对恶性肿瘤细胞表型的作用表现为促进细胞有丝分裂和血管形成，干扰细胞周期和抑制细胞凋亡，从而提高肿瘤细胞的生存能力[16]。该研究结果显示，Survivn蛋白阳性表达率在80例ESCC组织、20例正常食管组织的石蜡切片中分别为68.8%（55/80）和5.0%（1/20），ESCC与正常食管组织表达差异有统计学意义（P<0.05），结果表明Survivin蛋白在正常的食管正常组织中几乎不表达，在ESCC组织中则呈现高表达，提示其可能通过直接或者间接的作用抑制ESCC细胞的凋亡，同时通过干扰细胞有丝分裂促进恶性肿瘤细胞的异常增殖、恶性转化，最终导致ESCC的发生[17]。研究者牛朝霞等[18]，实验证明靶向抑制Survivin基因的表达能降低干扰组食管癌细胞的体外侵袭与迁移能力。Survivin基因的表达在食管癌侵袭、转移以及预后中具有极其重要作用。Survivin蛋白表达与食管癌患者临床TNM分期、肿瘤分化程度、淋巴转移等临床病理资料评估分析，发现当Survivin蛋白阴性，同时TNM I期、肿瘤分化程度高、无淋巴转移患者预后较好。推测可能由于Survivin蛋白表达缺失，其抑制肿瘤细胞凋亡的功能也丧失，细胞中增殖与凋亡之间的平衡得以维持，早期食管癌患者的生存期延长。该研究结果还显示Survivin蛋白阳性高表达与食管鳞癌患者性别、年龄和肿瘤分化程度差异无统计学意义（P>0.05），与ESCC患者TNM分期、肿瘤浸润深度、肿瘤大小和淋巴结是否转移差异有统计学意义（P<0.05）。Survivin 蛋白阳性时，细胞恶性程度高、腫瘤浸润至深层者、TNM II和III期、有淋巴结转移的患者预后较差。根据结果推测当Survivin 表达后，正常的凋亡减缓，促进肿瘤细胞无限制生长、有丝分裂和血管的生成，促进科肿瘤细胞的恶性转化，导致肿瘤的局部浸润和远处迁移，最终患者的生存期下降。
　　Egr-1是体内的重要调控因子，早期反应生长因子Egr-1定位于人染色体5q31.1，基因全长3 823 bp，包括两个外显子区，编码3.3 kb长度的成熟mRNA。Egr-1基因编码的和磷酸蛋白由535个氨基酸组成，分子量为82 kDa。该核磷酸蛋白N端有包含314个氨基酸残基的磷酸化位点，可以调节蛋白的活性，C端包含3个具有高度保守C2H2亚型锌指结构，能结合Egr-1下游的靶基因启动子序列5’GCGTGGGGCG3’或5’TCCTACCTCCTCC3’，从而参与调控细胞的生长、增殖、分化和凋亡[19-20]。转录因子Egr-1是调控细胞增殖及凋亡过程中重要的分子，它的激活与细胞正常的生长分化相关，即正常细胞发生异常增殖和分化则是肿瘤发生的重要环节。研究表明[21]，Egr-1在多种肿瘤中表达下调，而外源性Egr-1基因具有抑制肿瘤细胞生长和逆转肿瘤细胞恶性表型的作用。近年来多项研究针对Egr-1，但Egr-1与ESCC发生发展关系鲜见报道。该次研究发现Egr-1蛋白在80例ESCC组织、20例正常食管组织的石蜡切片中均表达，Egr-1在ESCC组织和正常食管组织中的低表达率分别为66.3%（53/80）和15.0%（3/20），差异有统计学意义（P<0.05）。ESCC中Egr-1蛋白阳性低表达与患者性别、肿瘤大小和肿瘤浸润深度差异无统计学意义（P>0.05），与患者年龄、TNM分期、肿瘤分化程度和淋巴结是否转移差异有统计学意义（P<0.05）。说明Egr-1在ESCC中扮演着重要的角色。研究者柯灿灿等[22]，实验发现Egr-1在卵巢癌组织中的表达与患者临床FIGO分期、分化程度以及淋巴结转移有关。并且FIGO分期越高、分化程度越低同时伴有淋巴结转移的患者Egr-1表达越低。也有研究显示[23]，Egr-1在乳腺癌细胞中是呈低表达状态的，但是患者在服用他莫昔芬治疗后，Egr-1与正常乳腺组织的表达水平不具有统计学的差异。刘敏姬等[24]研究发现，与结直肠癌组织相比，Egr-1蛋白在癌旁正常粘膜以及癌旁黏膜中的表达明显增高。Egr-1Egr-1蛋白在103例结直肠癌、癌旁黏膜和结直肠正常黏膜组织中均表达，阳性率分别为69.90%（72/103）、89.32%（92/103）和84.47%（87/103），结直肠癌和癌旁黏膜组织差异有统计学意义（P<0.05），结直肠癌和结直肠正常黏膜组织差异有统计学意义（P<0.05）。李雅琴等[25]收集了100例皮肤鳞癌和100例健康对照组织样本，采用免疫组化检测Egr-1蛋白表达及其与肿瘤转移的关系。与正常对照组组织样本Egr-1蛋白的阳性表达率36.00%（36/100）相比，皮肤鳞癌组织中Egr-1蛋白的阳性表达率为79.00%（79/100），显著增高（P<0.05）。综上，Egr-1在这些肿瘤中可能是抑癌基因的角色。 　　Survivin和Egr-1与肿瘤的关系较为复杂，二者与癌基因和抑癌基因的关系、对ESCC中靶基因调节的分子机制等尚未研究清楚，国内外对二者与放射诱导后相关基因表达变化以及对放射敏感性的影响研究也较少，对这些问题的不断深入研究和解决将有助于对ESCC个体化诊治起到基础理论作用。该研究运用免疫组化的方法联合检测ESCC中Survivin和Egr-1的表达情况，后期还可以尝试联合检测Survivin和Egr-1蛋白在ESCC患者血清中与组织中的表达，考察其是否可以成为ESCC新的肿瘤标记物，为ESCC的早期诊断提供新的方法。
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　　（收稿日期：2020-02-26）
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