HIF1α-shRNA表达载体的构建与鉴定

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　　摘 要
　　目的：构建 HIF1α-shRNA表达载体并鉴定，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用奠定基础。方法：设计合成两条互补的编码HIF1α-shRNA的DNA寡核苷酸单链，退火形成互补双链，后将退火产物与酶切线性化的表达载体pG1.1连接后，转化至感受态细胞DH5α中，提取重组质粒并酶切鉴定，挑取克隆正确的重组质粒去测序鉴定插入序列。结果：重组质粒酶切结果显示退火片段连接到pG1.1载体里，经测序分析重组质粒插入序列与合成的寡核苷酸序列一致。结论：HIF1α-shRNA表达载体构建成功，为后续研究提供基础。
　　关键词
　　HIF1α;shRNA;载体构建
　　中图分类号： Q78;R378.11                  文献标识码： A
　　DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.07.062
　　缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1， HIF-1）最初是从缺氧诱导的肝癌细胞Hep3B的细胞核中发现的一个转录因子，由氧敏感的α 亚基（HIF-1α）和持续稳定表达的β亚基（HIF-1β）以异源二聚体的形式组成，HIF-1α是调节亚单位，决定HIF-1的活性，HIF-1β则与稳定HIF-1及其二聚化有关[1]。已经证实，HIF-1可介导肿瘤细胞产生一系列的缺氧适应反应，与肿瘤细胞的糖酵解途径密切相关，使肿瘤细胞在相对缺氧的状态下获得更多的能量供应，以维持存活、生长和分裂[2]。本研究将构建HIF1α-shRNA表达载体，为进一步研究其在肿瘤发生发展中的作用提供生物学基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　表达载体pG1.1（武汉巴菲尔），限制性内切酶BsaI、SacI （美国NEB），T4 DNA连接酶、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒、感受态细胞DH5α（北京天根），DNA寡核苷酸由上海生工合成。
　　1.2 方法
　　1.2.1 序列设计合成
　　已验证有效干扰HIF1α表达的siRNA正义链序列为5'-GCCTCTTTGACAA
　　ACTTAA-3'，依据pG1.1载体的插入位点和接头结构，设计合成两条互补的编码HIF1α-shRNA的DNA寡核苷酸单链，结构为BsaI +Sense+Loop+Antisensecomplement+终止信号+SacI+BsaI，具体序列见表1。
　　1.2.2 载体酶切回收
　　用BSAI完全酶切pG1.1载体，1%琼脂糖凝胶电泳回收大片段，即为线性化载体。酶切体系如下：pG1.1 2μg，BsaI 2μl，10×buffer 4μl，100×BSA 0.4μl，H2O补足40μl，37℃水浴酶切过夜，酶切结果见图1。
　　1.2.3 退火形成双链
　　分别用30μl annealing buffer溶解2OD两条互补DNA寡核苷酸单链，各取2μl，加16μl annealing buffer混匀，94℃退火自然冷却至室温，各取1μl退火产物加99μl H2O做100倍稀释。
　　1.2.4 载体连接转化
　　连接反应体系如下：稀释退火片段1μl，线性化载体1μl，5×Ligase Buffer 2μl，T4 DNA Ligase 1μl，H2O 5μl，4℃反应过夜。取10μl连接产物转化感受态细胞DH5α，涂布于含Kana抗性（终浓度为30ug/ml）的LB平板上，37℃恒温培养箱培养过夜。从每个培养皿上挑取数个单克隆菌落接种于5ml含Kana抗性（终浓度为30ug/ml）的LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜。
　　1.2.5 载体鉴定
　　提取重组质粒并分别用SacI做酶切鉴定，酶切体系如下：DNA 8.5μl，10 ×Buffer 1μl，SacI 0.5μl，37℃水浴反应2h，1%琼脂糖凝胶电泳，挑取克隆正确的重组质粒去测序鉴定插入序列。
　　2 结果
　　因为载体pG1.1里面本来只有一个SacI的酶切位点，但是重组质粒能够被SacI酶切出一条约900bp DNA条带，说明退火片段连接到pG1.1载体里，酶切结果见图2。经测序分析重组质粒插入序列与合成的寡核苷酸序列一致，HIF1α-shRNA表达载体构建成功，测序比对结果见图3。
　　3 讨论
　　研究证明绝大多数实体肿瘤组织中存在缺氧微环境，这一刺激因素能增强肿瘤细胞抗凋亡能力、促进肿瘤血管生长、增加肿瘤对化疗药物耐受性，从多方面加速肿瘤的恶性进展，尤为重要的是缺氧能诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），并在肿瘤侵袭转移过程中发挥至关重要的作用[3]。肿瘤细胞对缺氧刺激的反应体现在下游靶基因的表达变化而影响细胞的生物学功能，而调控这些差异表达基因的最为重要的转录因子就是HIF[4]。
　　HIF转录因子包括HIF1、HIF2和HIF3，它们在缺氧环境中发挥各自不同的功能，其中HIF1已被证实参与调控肿瘤侵袭转移、血管形成、糖酵解等过程，并与卵巢癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤不良预后密切相关[5]。HIF1由α及β两个亚基聚合活化后才能入核调控下游靶基因的表达。HIF1α蛋白的氧依赖性降解区（oxygen-dependent degradation domain，ODD）脯氨酸在常氧條件下会被羟基化，使得HIF1α蛋白进入E3泛素连接酶VHL（Von Hippel Lindau）介导的泛素化降解途径，而β亚基（也被称为芳香烃受体核转位蛋白，aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT）为组成性表达，可稳定存在。在缺氧条件下，稳定的HIF1α与β亚基结合形成二聚体后入核，HIF1蛋白可作为转录因子募集CBP和p300结合到下游靶基因启动子或增强子中的HRE上，激活靶基因的转录[6]。因此，HIF1α的稳定性决定了HIF1的生物学功能的发挥。 　　本研究構建了HIF-1α-shRNA表达载体，经酶切和测序鉴定证实构建成功。该表达载体在细胞内转录生成shRNA后，通过Dicer酶剪切生成siRNA，从而干涉HIF-1α表达。该表达载体为后续研究HIF-1α的功能提供基础，可以瞬时干涉HIF-1α进一步筛选后得到稳定表达细胞株，观察缺氧环境下肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移等改变，从而更深入认识HIF-1α对肿瘤细胞的生物学作用。
　　参考文献
　　[1]Semenza GL， Wang GL.A nuclear fact or induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoiet in gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol， 1992; 12：5447-5454.
　　[2]Denko N C. Hypoxia ， HIF1 and glucose metabolism in t he solid tumour[J]. Nat Rev Cancer， 2008 ，14：1474-1478.
　　[3]Jiang J， Tang YL， Liang XH. EMT： a new vision of hypoxia promoting cancer progression[J].Cancer Biol Ther，2011，11（8）： 714-723.
　　[4]Tsai YP， Wu KJ. Hypoxia-regulated target genes implicated in tumor metastasis. Journal of biomedical science， 2012，19：102.
　　[5]Tang CM， Yu J. Hypoxia-inducible factor-1 as a therapeutic target in cancer. J Gastroenterol Hepatol， 2013，28（3）：401-405.
　　[6]Greer SN， Metcalf JL， Wang Y， Ohh M. The updated biology of hypoxia-inducible factor. EMBO J，2012，31（11）：2448-2460.
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