壶瓶碎米荠对硒酸钠胁迫响应研究

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　　摘要：通过在MS培养基中添加不同浓度的硒酸钠溶液（0、20、40、60、80、100、200、300 mg/L）来进行壶瓶碎米荠（Cardamine hupingshanensis）种子萌发培养，测定种子萌发率、幼苗成活率、黄化率、植株高度、根长、鲜重和干重、POD活性及CAT活性等生理生化指标，以探讨壶瓶碎米荠对硒酸钠胁迫的响应。结果表明，（1）低浓度的硒酸钠溶液促进壶瓶碎米荠植株生长量和生物量的增加，反之则抑制;（2）在40 mg/L硒酸钠溶液处理下，壶瓶碎米荠的发芽率和成苗率最高，且幼苗的根长、株高、鲜重和干重均达到最大值;（3）壶瓶碎米荠幼苗的黄化率随着硒酸钠溶液浓度的升高而升高;（4）壶瓶碎米荠的POD活性呈先降低后升高的趋势，在40 mg/L硒酸钠溶液处理时达到最低值;（5）壶瓶碎米荠的CAT活性总体上呈先升高后降低的趋势，在100 mg/L硒酸钠溶液处理时达到最高值。
　　关键词：壶瓶碎米荠（Cardamine hupingshanensis）; 硒胁迫; 生理特性
　　Abstract： Cardamine hupingshanensis seeds was cultivated in MS culture medium with different sodium selenate concentration （0， 20， 40， 60， 80， 100， 200， 300 mg/L）. The physiological and biochemical indexes such as seed germination rate，seedling survival rate，yellowing rate，plant height，root length， fresh weight，dry weight，POD activity and CAT activity were measured to discuss the response of selenate stress in pots to Cardamine hupingshanensis. The results showed that， the low concentration of sodium selenate was used to promote the growth and biomass of the Cardamine hupingshanensis，on the contrary， it would inhibit it. When the concentration of sodium selenate was 40 mg/L， Cardamine hupingshanensis had the highest germination rate and seedling rate， at the same time， the root length， plant height， fresh weight and dry weight of the seedlings reached the maximum value. The yellowing rate of Cardamine hupingshanensis seedlings increased with the increase of selenium salt concentration. The POD activity of the Cardamine hupingshanensis was decreased first and then increased， the lowest value reached at 40mg/L sodium selenate solution. The CAT activity of the Cardamine hupingshanensis was increased first and then decreased， the highest value reached at 100 mg/L sodium selenate solution.
　　Key words： Cardamine hupingshanensis; Se stress; physiological property
　　硒是人体必需的14种微量元素之一。硒在全世界的分布是很不均匀的，中国是缺硒最严重的国家之一，占国土面积72%的地区存在一条低硒地带[1]，人类约有40多种疾病如克山病[2]、癌症[3-6]和大骨节病[7]等与缺硒有关，硒对这些疾病有着不同程度的缓解和治愈作用，而人类直接或间接通过植物性食品来获取可在人体内发挥作用的硒[8]。近年来，在湖北省恩施土家族苗族自治州的富硒地区发现一种具有很强富集环境硒能力的多年生草本植物——壶瓶碎米荠（Cardamine hupingshanensis）。壶瓶碎米荠属于十字花科碎米荠属的草本植物，是中国特有的野生蔬菜，全株可食用，其营养价值较高。
　　硒对植物的生长发育具有不可替代的作用。硒能够促进植株的生长发育，增加植株内谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性[9]。硒能够促进种子萌发，但是这种促进作用与价态无关，可能与种子的酶活性和物质代谢有关[10]。研究植物对硒的吸收、代谢以及耐受机制，不仅可以指导如何生产富硒粮食，而且可以有效解决人体缺硒或者硒摄入不足等问题 [11]。因此，寻找富硒植物，观察了解植物对硒的吸收及耐受机制，建立起相应的体系，对人类治愈某些疾病有着重要的意义。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料及处理
　　试验材料：人工繁殖的壶瓶碎米荠种子。
　　试验药品：硒酸盐、0.1%的氯化汞溶液、配制MS培养基所需的大量元素溶液、微量元素溶液、有機物溶液、铁盐溶液、石英砂、磷酸缓冲液、愈创木酚、过氧化氢溶液等。 　　仪器设备：100 mL移液枪、1 000 mL移液枪、培养皿、培养瓶、超净工作台、高压灭菌锅、剪刀、镊子等。
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 种子的硒酸钠处理 以0、20、40、60、80、100、200和300 mg/L的硒酸钠浓度梯度配制MS培养基，每个培养基定量为30 mL，确保每个培养基除浓度梯度外的条件都一样，每个处理重复3次。
　　培养基灭菌：将以上培养基放入高压灭菌锅中，并于121 ℃高压灭菌30 min，灭菌后将其置于超净工作台中。
　　种子消毒与接种：将壶瓶碎米荠种子放至10 mL离心管中，加入刚配制的75%乙醇溶液至浸没全部种子，30 s后吸出乙醇溶液，用去离子水清洗1次，加入足够浸泡种子的0.1%氯化汞，10 min后吸出氯化汞，再用去离子水清洗6次。种子消毒后，于每个培养基中接种10～20颗种子。
　　1.2.2 测定指标及方法 接种后，观察并记录下种子在各个浓度的萌发及发芽情况，并在7 d时统计各个浓度硒酸钠处理下种子的发芽率。20 d时统计种子长成幼苗的个数，并统计种子的成苗率。25 d时统计种子幼苗发黄的情况，计算出种子的黄化率。将种子萌发生长25 d左右的幼苗从培养基上取出来，置于天平上称量幼苗的重量，然后用尺子测量株高、根长，最后置于烘干箱中烘干24 h，称量干重。过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）的活性分别采用愈创木酚法[12]和紫外吸收法测定[13]。
　　2 结果与分析
　　2.1 硒酸钠处理对壶瓶碎米荠种子发芽率、成苗率和起始黄化率的影响
　　在MS培养基中加入不同浓度硒酸钠溶液处理壶瓶碎米荠种子时，壶瓶碎米荠种子均能萌发和成苗。由图1可知，当浓度范围为 0～40 mg/L时，发芽率随浓度增大而不断增大，且浓度为40 mg/L时发芽率达到最大值，高达79.59%，比对照组发芽率高6.71个百分点;此浓度下成苗率也达到最大值，为75.51%，比对照组成苗率高9.41个百分点。但当硒酸钠溶液浓度超过40 mg/L时，发芽率、成苗率均随着硒酸盐溶液浓度的增大而不断降低，植株发芽和成苗均受到抑制，且浓度为300 mg/L时发芽率达到最小值36.84%，比对照组的发芽率低了36.04个百分点，成苗率也达到最低值，表明当硒酸钠浓度为300 mg/L时极度抑制壶瓶碎米荠成苗。当硒酸钠浓度为40 mg/L时，植物开始出现黄化现象，随着硒酸钠溶液浓度的不断增加，壶瓶碎米荠的起始黄化率也不断增大。当浓度为200 mg/L时，起始黄化率达到最大值42.86%，说明壶瓶碎米荠幼苗能适应较低浓度的硒酸盐，而当硒酸盐的浓度较高时，其幼苗黄化率较高。
　　2.2 硒酸钠处理对壶瓶碎米荠苗生长量的影响
　　由图2可知，壶瓶碎米荠的平均根长与硒酸钠的浓度有着密切的关系。不同浓度硒酸钠溶液处理壶瓶碎米荠种子，所得植株的根长在0～40 mg/L范围内随浓度的增加而不断增加，根长的生长得到促进，且在40 mg/L时根长达到最高值1.459 cm，高于对照组的1.120 cm，促进作用最为明显;但硒酸钠浓度超过40 mg/L时，随着浓度的增加，壶瓶碎米荠植株的根长不断减小，根长生长受到了抑制，且所加硒酸钠溶液浓度越大，抑制作用越明显，其中浓度为300 mg/L时根长为0.187 cm，抑制作用最为明显。
　　由图3可知，不同浓度硒酸钠溶液处理壶瓶碎米荠种子，所得的壶瓶碎米荠植株的株高在0～40 mg/L范围内随浓度的增加而不断增加，植株株高得到促进，且在40 mg/L时株高达到最大值2.813 cm，高于对照组的2.410 cm，促进作用最为明显;但硒酸钠浓度超过40 mg/L时，随着浓度的增加，株高不断变小，生长受到抑制，且浓度越大，抑制作用越明显，其中浓度为300 mg/L时株高仅为0.813 cm，抑制作用最明显。这说明低浓度的硒酸钠对壶瓶碎米荠幼苗的生长起促进作用，而高浓度的硒酸钠对壶瓶碎米荠的生长有着抑制作用。根长的数值规律与株高的数值规律有相似之处，总趋势是随着硒酸钠浓度的增加先增高后降低。由此可推测，壶瓶碎米荠的根长与株高两者之间有一定的联系。
　　2.2 硒酸钠处理对壶瓶碎米荠苗生物量的影响
　　由表1可知，不同浓度硒酸钠溶液处理壶瓶碎米荠种子，所得植株的鲜重在0～40 mg/L范围内随浓度的增加而不断增加，植株鲜重受到促进，且在浓度为40 mg/L时植株鲜重达到最高值154.063 mg，高于对照组的134.320 mg，促进作用最为明显;但是当硒酸钠浓度超过40 mg/L时，随着浓度的增加，植株鲜重不断减小，当浓度为300 mg/L时鲜重仅为49.000 mg，受到的抑制最强。
　　在硒酸钠溶液浓度为0～40 mg/L时，植株的干重随着硒酸钠溶液浓度的增加而增加，且在浓度为40 mg/L时干重达到最高值18.006 mg，高于对照组的12.393 mg，促进作用最为明显;但是当硒酸钠浓度超过40 mg/L时，随着浓度的增加，植株的干重不断减少，且浓度越大，抑制作用越明显，其中浓度为300 mg/L时干重为3.769 mg，抑制作用最明显。
　　2.3 硒酸钠处理对壶瓶碎米荠幼苗过氧化物酶（POD）活性的影响
　　由图4可知，不同浓度硒酸钠溶液处理壶瓶碎米荠种子，所得的壶瓶碎米荠植株的POD活性在0～40 mg/L范围内随浓度的增加而不断减小，植株POD活性受到抑制，且浓度为40 mg/L时活性达到最低值2.553 △OD470 nm/（min?g Fw）;但是当硒酸钠浓度超过40 mg/L时，随着浓度的增加，壶瓶碎米荠植株的POD活性不断增大，当浓度为300 mg/L时POD活性达到最大值41.804 △OD470 nm/（min?g Fw）。说明低浓度的硒盐处理使幼苗过氧化物酶的活性降低，而高浓度使幼苗體内组织活性老化，从而导致植株体内靠产生更多的过氧化物酶来对抗衰老。 　　2.4 硒处理对壶瓶碎米荠幼苗过氧化氢酶（CAT）活性的影响
　　不同浓度硒酸钠溶液处理壶瓶碎米荠种子，总体上来说，所得的壶瓶碎米荠植株的CAT活性在40～100 mg/L范围内随浓度增加而不断增加，植株CAT活性受到促进，且在浓度为100 mg/L时活性达到最高值119.307 μ/g Fw，明显高于对照组，高浓度条件下CAT的活性比较高，说明此时壶瓶碎米荠幼苗产生的过氧化氢比较多，加速了植物的衰老。但是当硒酸钠浓度超过100 mg/L时，随着浓度的增加，壶瓶碎米荠植株的CAT活性不断减小。
　　3 小结与讨论
　　李登超[14]、刘新伟等[15]、陶爱芬等[16]的研究表明，低浓度硒可以促进聚硒植物的生长，反之则抑制其生长。在本研究中，当硒酸钠浓度为40 mg/L时，壶瓶碎米荠的发芽率和成苗率达到最大值，分别为79.59%和75.51%，幼苗的平均根长、株高、株重和干重均也达到最大值，且都在达到最大值后随着硒酸钠浓度升高呈下降趋势。这说明低浓度的硒酸钠溶液处理对壶瓶碎米荠的生长发育起到促进作用，反之则抑制其生长。
　　硒促进种子萌发可能是因为影响到种子的酶活性和物质代谢 [17]。硒对植物具有两种截然不同的作用[18]，一般在低浓度硒条件下，硒既可以起到减缓植物衰老、促进植物生长、降低植物脂质过氧化反应的作用，也可以起到缓解氧化胁迫和某些逆境条件对植物产生危害的作用;但在高浓度条件下，硒对植物具有毒害作用，会降低作物产量。本研究表明，低浓度的硒盐可以增加壶瓶碎米荠的重量和高度，因此，在实际生产中可在低硒土壤中种植壶瓶碎米荠以获取高生物量，更好地满足人体对硒的需求。
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