一株野生古巴栓孔菌的鉴定及系统发育分析

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　　摘    要：以福建省厦门市厦门植物园中采集的一株野生真菌为研究对象，观测其子实体的形态特征以及菌丝的生长情况，并对其进行了分子鉴定。在GenBank数据库中进行Blast比对ITS序列后，采用NJ（Neighbor-Joining）邻接法构建出系统发育树，鉴定出该野生真菌为古巴栓孔菌（Tramtes cubensis），属于真菌门（Eumycota），担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales） ，多孔菌科（Polyporaceae），栓菌属（Trametes）。
　　关键词：野生大型真菌;古巴栓孔菌;ITS序列;鉴定
　　中图分类号： S646       文献标识码： A       DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.07.001
　　Abstract： In this study， a wild macro-fungus was utilized as the materials， which collected from Xiamen botanical garden in Xiamen city （Fujian province）. In order to investigate the fungus， the morphological characteristics of its fruiting body and the growth status of its mycelium were observed， and the molecular identification was performed in this experiment. The genomic DNA of fungal hyphae was extracted， and the ITS region of rDNA was amplified by PCR method using specific primers， and then sequenced. The sequence similarity comparison was using BLAST searches in GenBank， then the phylogenetic tree was built by NJ（Neighbor-Joining） method using Mega6 software. The results showed that the wild fungus was identified as Eumycota， Basidiomycotina， Hymenomycetes ，Aphyllophorales， Polyporaceae， Tramtes cubensis， a kind of wood rotting fungus.
　　Key words： wild macrofungi; Trametes cubensis; ITS sequence; identification
　　中国是世界上较早认识和利用多孔菌的国家，在公元25年—220年，《神农本草经》 里就有关灵芝的记载[1]，李时珍《本草纲目》中记录的更加详细[2]。我国野生菌资源豐富，但是利用开发的较少。栓菌属中一些菌物具有很高的药用价值和生物学活性，由于栓菌属分类混乱且不易被划清属间界限[3-4]，极大地影响了栓菌属的开发与利用。理清他们之间的亲缘属关系对研究多孔菌的药用价值具有重要的指导意义。
　　栓菌属（Trametes）是一类木腐菌，大多数生长在倒腐木或树桩上。栓菌属（Trametes）种类多，分布广，在热带至亚热带的各种森林生态系统中均有分布，在我国主要分布在四川、湖南、广东、广西、云南、福建、海南等地。栓菌属中部分种具有良好的药用价值，可以用来治疗炎症、肺结核、支气管、降血糖抗癌和抗氧化等[5-9]，陈俊威和徐旭东[10]研究发现红栓菌的胞外多糖具有抗肿瘤提高免疫力的作用。任刚[11]研究了栓孔菌对癌细胞具有一定的增殖抑制作用。栓菌属具有一定的工业应用价值，司静等[12]研究了东方栓孔菌发酵所得粗酶液对结晶紫脱色效果较好。古巴栓孔菌的药用功能目前还尚未有报道，确定其种属关系为古巴栓孔菌的进一步开发利用与驯化栽培奠定基础。
　　1 材料和方法
　　1.1 试验材料
　　1.1.1 供试子实体 供试子实体采自福建省厦门市厦门热带植物园，通过组织分离得到斜面菌种，命名为TNCY002，保藏于天津农学院食用菌研发中心。
　　1.1.2 菌种活化培养基 PDA固体培养基（%）：马铃薯20，葡萄糖2，琼脂2，pH值自然。
　　1.1.3 PCR扩增的引物
　　ITS1 （5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）
　　ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 形态特征观察 观察子实体颜色，纹路等典型外观形态特征，测量子实体长度，宽度，厚度，拍照。将子实体组织放于25 ℃下静置培养8 d菌丝长满平板。
　　1.2.2 菌丝DNA提取及凝胶电泳检测 在菌丝中加入液氮快速研磨至粉状，称取质量为0.1 g菌丝的粉末于1.5 mL的离心管中，然后按照DNA提取试剂盒（天津兰瑞生物科技有限公司）说明书进行操作，获取基因组DNA，将提取的DNA置于-20 ℃保存备用。取DNA样品5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳30 min，用凝胶成像系统观察基因组DNA的提取质量并拍照记录。
　　1.2.3 ITS-PCR扩增及序列比对 以基因组DNA为模板，采用真菌通用引物ITS1和ITS4 进行PCR扩增。rDNA-ITS 扩增反应体系（20 μL）：10×PCR buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL，ddH2O 10.9 μL，ITS1 1.2 μL，ITS4 1.2 μL，模板3 μL，Taq酶0.1 μL。PCR扩增反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40个循环，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃终止。 　　将PCR扩增产物进行电泳验证后，送至天津生物公司进行测序。测序结果序列在 NCBI进行核酸序列BLAST比对分析。
　　1.2.4 系统发育分析 在NCBI上下载同源序列，将TNCY002的ITS序列通过BLAST与GENBANK数据库进行比对，选取一些与该序列同源性较高的序列，以及同属不同种的真菌序列;利用MEGA6.0软件采用NJ（Neighbor-Joining）邻接法构建系统发育树，测试的重复数（number of replicates）选择1000次。根据发育树分支处的bootstrap值的大小确定供试菌株的种属关系。
　　2 结果与分析
　　2.1 子实体生态环境调查及形态鉴定
　　供试菌株子实体采集于福建省厦门市厦门植物园的一颗枯树上，共采集4个子实体。采集的野生真菌的子实体形态特征如图1，子实体外形较大，幼小期呈灰白色。成熟期的子实体颜色变深，呈灰褐色或深褐色。木栓质，无菌柄，侧生。菌盖（9.3～13.5） cm×（6.8～7.2） cm，厚7.3～14.2 mm，半圆形或近似圆形，菌盖呈灰褐色，有较宽同心环带及棱纹，菌盖边缘薄，菌肉为深褐色，中部较厚。菌盖中心处常有褐色小疣凸。
　　菌丝形态见图2，菌丝都以接种块为中心，向外生长成圆形绒毛状，菌丝呈白色同心环状，环间凹陷，菌丝边缘较整齐。在平板内不分泌色素。平板菌丝培养8 d后即可长满。斜面菌丝培养8 d后会沿着玻璃壁长出气生菌丝。
　　2.2 菌丝DNA提取及凝胶电泳检测
　　对菌丝体进行DNA提取，电泳条带清晰、较明亮，无明显后拖尾现象（图3），提取的基因组DNA可用于后续试验。
　　2.3 ITS-PCR扩增及序列比对
　　以提取的DNA为模板，ITS1、ITS4 为引物进行扩增，扩增产物电泳后出现了清晰明亮的单一带，结果显示片段大小约为500～700 bp之间（图4）。
　　2.4 TNCY002的系统进化分析
　　将PCR扩增产物送样测序，得到的序列长度为645 bp，序列在GenBank上的登录号是MN068933.1。通过MEGA6.0得到的系统发育树如图5。
　　ITS序列测定结果表明，PCR扩增出来的产物长度为645 bp，登录NCBI经过BLAST将测序结果进行比对，构建出进化树如图5所示， TNCY002与古巴栓孔菌JN164922.1 （Trametes cubensis）遗传距离最近，经NCBI上比对相似度高达99.84%，表明TNCY002和古巴栓孔菌为相同种属，即供试菌株属于真菌门（Eumycota），担子菌亚门（Basidiomycotina），层菌纲（Hymenomycetes）非褶菌目（Aphyllophorales） ，多孔菌科（Polyporaceae），栓菌属（Trametes），古巴栓孔菌（Tramtes cubensis）。
　　3 结论与讨论
　　我国是一个生物多样性的国家，栓菌作为森林中最为常见的一类白腐菌，分布广，种类多。栓菌属的菌株形态相似度极高，导致对其错误的命名，严重影响了栓菌属菌物在实际生产中的应用。Linnateus从1753最早开始对多孔菌科的分类进行研究，自1835年Fries建立的多孔菌属，1874年Fries在多孔菌科里划分了10个种属，分别是多孔菌属（polyporus），栓菌属（Trametes），牛肝菌属（Boletus），牛舌菌属（Fistulina），迷孔菌属（Daedalea），大孔菌属（Favolus），蜂窝孔菌属（Hexagona），胶皱孔菌属（Merulius）等[13]，其中栓菌属菌物是一类广泛存在于大自然的大型真菌。迄今为止，栓菌属中被驯化的有云芝、香栓菌[14]、血红栓菌等。但是对于栓菌属中的古巴栓孔菌目前对其药用价值及生理活性研究较少。Olou B A等[15]， Justo A等[16]只研究了栓菌属的分类及菌丝的结构特征。
　　野生菌资源的鉴定是其开发利用的前提和基础。本试验采用ITS序列，依据序列相似性<95%可鉴别为相同科;95%～99%可鉴别为相同属;>99%可鉴别为相同种[17]。本试验得出鉴定结果是供试菌株TNCY002为栓菌属（Trametes）古巴栓孔菌（Trametes cubensis）。
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