4种玉米自交系幼胚遗传再生体系的建立
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摘要：选取4种玉米自交系H99、A188、7922和1322的幼胚作为外植体，接种于10种不同诱导培养基上，诱导愈伤组织并建立遗传再生体系，同时探讨了不同基因型、培养基种类、幼胚大小、蔗糖浓度、激素浓度和配比对愈伤组织诱导率的影响。结果表明：基因型对愈伤组织诱导率高低影响显著，4种基因型玉米幼胚在诱导培养基中均产生了愈伤组织，但继代培养后只有H99能诱导出胚性愈伤组织，诱导率为46.2%；对于不同基因型培养基诱导效果依次为N6>MB>MS；选择幼胚长度为1.5～2.0 mm、添加蔗糖浓度为30 g/L、2，4-D浓度为2.0 mg/L及AgNO3浓度为 10 mg/L 时玉米愈伤组织诱导率最高且质量较好。
关键词：玉米；再生体系；自交系；愈伤组织诱导率
中图分类号： S513.03文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）10-0066-03
收稿日期：2015-11-10
基金项目：吉林农业科技学院青年基金项目（编号：吉农院合字[2013]第210号）。
作者简介：楚海娇（1984―），女，吉林辽源人，硕士，助教，主要研究方向为玉米遗传转化。E-mail：chuhaijiao1227@163.com。
通信作者：关淑艳，博士，副教授，主要从事生物技术在作物遗传育种中的应用研究。E-mail：fengrongl@163.com。我国是世界玉米大国，玉米作为重要的粮、饲作物对我国经济发展和市场稳定具有举足轻重的作用[1]。可以通过基因工程手段改良玉米的品种和农艺性状，而建立高效的体细胞再生体系是遗传转化的关键。玉米优良基因型遗传再生体系的建立一直是人们研究的热点[2]。玉米首次诱导出愈伤组织是Larue在1949年用甜玉米的胚作为外植体，但未获得再生植株。直到1975年，Green等用A188的未成熟胚作外植体，诱导出二倍体愈伤组织，并获得再生植株，从而得到了第1株无性系植株[3]。目前，已能从多种外植体中诱导出愈伤组织，并再生植株。而以玉米幼胚为外植体进行培养，诱导愈伤组织的效率高、再生能力强，可大大提高育种效率。玉米组织培养的影响因素较为复杂，一些优良自交系的组织培养还存在一定困难。本试验设计了10种不同诱导培养基对4种优良玉米自交系的愈伤组织进行诱导，并再生植株，目的是探寻出这4种玉米自交系遗传再生体系建立的条件，为建立高效的玉米转基因受体系统奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
优良玉米自交系H99、A188、7922和1322的幼胚。
1.2培养基
1.2.1诱导培养基本试验设计了10种基本培养基进行愈伤组织的诱导研究（表1）。
1.2.2继代培养基继代培养基添加2，4-D的浓度为 1 mg/L。
1.2.3分化培养基分化培养基添加IBA 0.8 mg/L和 6-BA 1.5 mg/L。
1.2.4生根培养基生根培养基添加NAA 1.5 mg/L和活性炭1.5 g/L。
1.3方法
1.3.1玉米幼胚的剥离在超净工作台上对授粉13 d左右的幼胚进行消毒，冲洗。挑取不同大小的幼胚接种于诱导培养基上，每皿接种30个幼胚，25 ℃避光条件下培养15 d左右（其中经过2次去芽处理），产生Ⅰ型初始愈伤组织。筛选出淡黄色、颗粒状、表面干燥的愈伤组织进行继代培养、分化培养、生根培养及移栽。
1.3.2愈伤组织诱导率的计算公式如下：
愈伤组织诱导率=愈伤组织块数/接种幼胚数×100%；
胚性愈伤组织诱导率=胚性愈伤组织块数/接种幼胚数×100%。
2结果与分析
4种基因型玉米幼胚在最适培养基中均能产生初始愈伤组织。继代培养后，自交系H99形成了松脆、淡黄色颗粒状的Ⅱ型愈伤组织；自交系A188和7922的愈伤组织多为乳白色、硬壳状，不易继代；1322产生的愈伤组织结构松软、黏稠状，继代后易褐变，后两者为非胚性愈伤组织。
2.1基因型对诱导率的影响
基因型不同，愈伤诱导率存在差异[4]。继代2～3次后，统计胚性愈伤组织诱导率。其中H99的诱导率最高，达462%，最低为A188，只有10.0%。随着继代次数的增加，只有H99能保持良好的生长状态，形成结构松散的Ⅱ型愈伤组织；A188和7922逐渐褐化死亡；1322在继代后多出现松软黏稠状的愈伤组织，诱导率下降（表2）。说明继代中愈伤组织的生长对基因型的依赖性很强。
2.2培养基对诱导率的影响
分别采用3种基本培养基对玉米幼胚进行诱导，从表3中可以看出，采用不同的培养基，诱导情况差异显著。使用N6培养基，4种基因型的诱导率均较高。但H99和1322在N6培养基中出愈率最高，分别为46.2%和26.7%；对于A188而言，最适培养基为MB；对于7922来说，N6和MB培养基均可诱导出愈伤组织，但胚性均不高；4种基因型在MS培养基中均诱导不出胚性愈伤组织。
2.3幼胚长度对诱导率的影响
有研究证明，基因型相同时幼胚大小对愈伤组织诱导率有影响[5]。本试验挑取基因型H99和A188不同长度幼胚进行愈伤组织诱导发现：幼胚长度为2.0 mm时，愈伤组织诱导率最高，且生长良好；当幼胚长度小于1.5 mm时，愈伤生长缓慢，诱导率呈下降趋势；当幼胚长度大于 2.0 mm 时，幼胚根芽分化现象比较严重，用镊子将根芽夹去，可以提高幼胚出愈率（表4）。因此认为，幼胚长度为1.5～2.0 mm时较适宜接种。
2.4蔗糖浓度对诱导率的影响
在植物组织培养的培养基中，需要碳源为植物组织提供能量，实验室多采用蔗糖作为碳源物质。因为蔗糖能更好地调节培养基内的渗透压，同时在一定程度上能减少微生物的污染。
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