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离子色谱法检测化妆品中L—羟脯氨酸方法研究

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  摘 要:建立了一种离子色谱法测定含胶原蛋白类化妆品中L-羟脯氨酸的方法。采用Dionex? AminoPac? PA10 (2×250mm)分析柱,电化学检测器,流动相为水- NaOH溶液-NaAc溶液,梯度洗脱,流速为0.25mL/min,柱温为30℃。结果表明,在5 μg/mL~100 μg/mL范围内,L-羟脯氨酸浓度与峰面积呈良好线性关系,相关系数R为0.9998,检测限和定量限分别为0.15μg/mL和0.5 μg/mL。平均加标回收率为95.8%,RSD为3.4% (n=6)。此方法简便、准确,可用于检测胶原蛋白类化妆品的L-羟脯氨酸含量,为化妆品的常规检测提供技术参考。
  关键词:L-羟脯氨酸;化妆品;离子色谱
  胶原蛋白是胶原的水解产物,是动物结缔组织中主要成分,也是哺乳动物体内含量最多、分布最广的天然功能性蛋白,占蛋白质总量的25%~30%[1-2]。胶原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性以及生物功能活性,因此,在食品、医药、组织工程、化妆品等领域获得广泛应用[3-4]。胶原蛋白在化妆品中添加量较低,样品基质复杂,前处理繁琐,因此其定量检测一直是化妆品功效评价及质量监控的难点。L-羟脯氨酸(L(-)-hydroxyproline,L-Hyp)是一种非必需氨基酸,是胶原组织的主要成分之一,且为胶原中特有的氨基酸,约占胶原氨基酸总量的10%,胶原蛋白含量可以根据L-Hyp含量乘以相应系数得到,因此,检测L-Hyp可反映胶原蛋白指标情况,例如,目前食品中胶原蛋白检测主要以L-Hyp作为有效指标[5-6]。
  目前L-Hyp的测定方法主要为氨基酸自动分析仪、液相色谱/质谱联用法,但是该类设备相对昂贵。此外还有比色法、高效液相色谱法等,然而前者样品处理相对较为繁琐,且易出现假阳性现象,后者则需要对L-Hyp进行柱前衍生化,同样繁琐。因此,本文建立了一种离子色谱法(IC)检测化妆品中L-Hyp的方法,避免了昂贵仪器的使用,同时也简化了检测流程,为化妆品中胶原蛋白类含量的确定提供了技术支持,进而为化妆品生产过程中的质量控制以及后期的功效评价服务。
  1 实验部分
  1.1 主要仪器及试剂
  Dionex ICS3000离子色谱仪(配电化学检测器);AminoPac PA10色谱柱(带保护柱)(Thermo Fisher);Millipore超纯水仪;氮吹仪。
  L-羟脯氨酸标准品(纯度>99%);NaOH(Alfa Aesar 50%氢氧化钠);醋酸钠(sigma-aldrich);浓盐酸(12 mol/L,德国Merck公司)。
  1.2 实验方法
  1.2.1 样品前处理
  称取样品0.5 g(精确值0.1 mg)至安瓿瓶中,加入10 mL 6mol/L盐酸,氮吹3min后迅速热封;将安瓿瓶置于110 ℃恒温烘箱中水解22 h,水解产物转移至50 mL容量瓶,用超纯水定容至刻度。取1 mL定容后的水解液于40 ℃氮吹至干,加入1~2 mL超纯水继续氮吹至干,最后用1 mL 0.1mol/L盐酸复溶,0.22 μm滤膜过滤后上机。
  1.2.2 标准曲线制备
  精密称取L-羟脯氨酸标准品50 mg于50mL容量瓶中,用0.1mol/L盐酸定容至刻度得标准品储备液。分别取50μL,100μL,200μL,500μL,1000μL标准储备液于10mL容量瓶中,用0.1mol/L盐酸定容,制得系列浓度为5μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,50μg/mL,100μg/mL的标准溶液。
  1.2.3 色谱条件
  色谱柱:AminoPacPA10氨基酸专用分析柱(2×250 mm),保护柱(2×50mm);流动相:A:超纯水;B:250mmol/LNaOH溶液;C:1mol/L醋酸钠溶液;流速:0.25mL/min;进样量:25μL;柱温:30℃;洗脱程序见表1。
  2 结果与讨论
  2.1 方法考察
  2.1.1标准曲线、检出限和定量限
  按1.2.2制备标准曲线,上机检测。以标准品浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,线性回归方程为:y=4.7226x+79.891,R2=0.9998。结果表明,L-羟脯氨酸在5μg/mL~100μg/mL范围内呈良好线性关系,见图1。
  2.1.2 重复性
  取20 μg/mL标准品溶液6份,按1.2.1方法处理后上机检测,结果见表3,测得结果的相对标准偏差RSD为2.62%,表明该方法重复性良好。
  2.1.3 样品加标回收率
  选取已知L-羟脯氨酸含量的某市售化妆品,精密称取6份,分别加入20?g/mL标准品溶液1mL,充分混合后按1.2.1方法处理后上机检测,记录峰面积,根据线性方程计算样品中L-羟脯氨酸含量,得出相应回收率。结果表明,L-羟脯氨酸回收率在91.3%~98.9%,平均回收率为95.8%,相应的测定结果的RSD为3.4%(n=6)。该方法准确度良好。
  2.2 样品测试
  选取8个市售含胶原蛋白类化妆品样品,按本方法进行检测,结果见表4。羟脯氨酸作为胶原和胶原蛋白中的特殊蛋白質,其含量一般约为胶原氨基酸总量的10%,其含量是目前食品、保健品及动物组织中胶原和胶原蛋白定量的常用换算方法。因此,本方法以10为折算系数,计算化妆品中胶原蛋白含量(见表5)。从表中看见,这些宣称含有胶原蛋白的样品中所含胶原蛋白含量参差不齐,甚至有的含量为0,因此,消费者选购时需要注意。
  3 结论
  本文阐述了一种离子色谱检测化妆品中L-羟脯氨酸的方法,该方法灵敏度高,无需衍生化,无需昂贵的氨基酸自动分析仪,操作简单,可应用于含胶原蛋白类化妆品的检测和质量控制,为化妆品功能性成分日常检测提供技术参考。
  参考文献:
  [1] Hulmes DJ.Building collagen molecules,fibril,and suprafibrillar structures. J Struct Biol,2002,37(1-2):2-10.
  [2] Jerome AW,John AMRl.Immunology of collagen-based biomaterials.In:Donald LW.Biomaterials and bioengineering handbook.Marcel Dekker.Inc.USA,2000:739-760.
  [3]王旭楠,郭立群,周洁,等.高效液相色谱法测定化妆品中胶原蛋白含量[J].日用化学品科学,2018,41(8):10-13.
  [4]蔡梅,吉文亮,刘华良,等,氨基酸自动分析仪对牛乳中羟脯氨酸快速测定方法研究[J].中国食品卫生杂志,2012, 24(6):542-545.
  [5]蔡伟江,陈晓霞.液相色谱—串联质谱法测定保健品中L-羟脯氨酸含量[J].食品安全质量检测学报,2015,6(02):667-672.
  [6]王旭波,徐利丽,郑洁,等.柱前衍生化-HPLC法测定市售3种胶类药材中L-羟脯氨酸和胶原蛋白的含量[J].中国药房,2017,28(27):3824-3827.
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