Nrf2-ARE信号通路在间歇性低氧胰腺组织中的作用及银杏叶提取物的干预机理

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　　摘要：目的  觀察Nrf2-ARE信号通路对慢性间歇性低氧胰腺组织的影响及银杏叶提取物对其的干预机理。方法  选取C57BL/6雄性小鼠、Nrf2基因敲除型雄性小鼠各54只，随机分为常氧对照组1、2，间歇性低氧组1、2，Nrf2激活剂组，抗体阻断组，银杏叶提取物（EGB）低、中、高浓度组，每组6只。除常氧对照组外，其余各组小鼠循环给予氮气和氧气建立间歇性低氧模型。Nrf2激活剂组腹腔注射莱菔硫烷，抗体阻断组腹腔注射抗Nrf2抗体，EGB低、中、高浓度组分别予EGB50、100、200 mg/（kg·d）灌胃，常氧对照组予等量生理盐水干预。干预10周后用Western-Blot和RT-PCR分别检测胰腺组织中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS蛋白和mRNA的表达水平。结果  野生型小鼠中，与间歇性低氧组比较，Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS在Nrf2激活组、EGB高浓度组中蛋白和mRNA表达均升高，在抗体阻断组中蛋白和mRNA表达均降低（P<0.05）;基因敲除型小鼠中，与间歇性低氧组比较，HO-1在Nrf2激活组、EGB高浓度组中蛋白和mRNA表达均升高（P<0.05）;NQO1在EGB中浓度组中蛋白和mRNA表达均升高（P<0.05）;γ-GCS在EGB中、高浓度组中蛋白和mRNA表达均升高（P<0.05）。结论  间歇性低氧导致的氧化应激参与了OSAS的发生发展过程，可能是OSAS胰腺组织损伤的主要病理生理机制。EGB通过促进Nrf2-ARE信号通路介导的抗氧化反应，保护胰腺组织免受间歇性低氧诱导的损伤。
　　关键词：银杏叶提取物;间歇性低氧;Nrf2/ARE信号通路;氧化应激;胰腺组织
　　中图分类号：R567                                 文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.01.019
　　文章编号：1006-1959（2020）01-0057-04
　　Role of Nrf2-ARE Signaling Pathway in Intermittent Hypoxic Pancreatic Tissue and
　　Intervention Mechanism of Ginkgo Biloba Extract
　　XIAO Li-jun，ZHOU Yan，TANG Yu-fei
　　（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，the Affiliated Hospital of Guilin Medical College，
　　Guilin 541001，Guangxi，China）
　　Abstract：Objective  To observe the effect of Nrf2-ARE signaling pathway on chronic intermittent hypoxic pancreatic tissue and the intervention mechanism of Ginkgo biloba extract. Methods  In that C57BL/6 male mice，54 of the Nrf2 gene knock-out male mice were selected，randomly divided into normoxic control group 1， 2， intermittent hypoxia group 1， 2， Nrf2 activator group， antibody blocking group， Ginkgo biloba extract （EGB） low， medium and high concentration groups， 6 in each group. Except the normoxic control group， the other groups of mice were cyclically given nitrogen and oxygen to establish an intermittent hypoxia model. The Nrf2 activator group was injected intraperitoneally with lymesulfane， and the antibody blocking group was intraperitoneally injected with anti-Nrf2 antibody. The EGB low， medium， and high concentration groups were given intragastrically with EGB50， 100， and 200 mg/（kg·d）. Equal volume of saline intervention. After 10 weeks of intervention， Western-Blot and RT-PCR were used to detect the expression levels of Nrf2， HO-1， NQO1， γ-GCS protein and mRNA in pancreatic tissue， respectively.Results  In wild-type mice， compared with the intermittent hypoxia group， Nrf2， HO-1， NQO1， and γ-GCS were found in the Nrf2 activated group，the protein and mRNA expressions were increased in the EGB high concentration group， and the protein and mRNA expressions were decreased in the antibody blocking group （P<0.05）.In the knockout mice， compared with the intermittent hypoxia group， HO-1 protein and mRNA expression were increased in the Nrf2 activated group and EGB high-concentration group （P<0.05）;The protein and mRNA expressions of NQO1 in the EGB medium concentration group were increased （P<0.05）; the γ-GCS protein and mRNA expression were increased in the EGB medium and high concentration groups （P<0.05）. Conclusion  Oxidative stress caused by intermittent hypoxia is involved in the development of OSAS and may be the main pathophysiological mechanism of OSAS pancreatic tissue injury. EGB protects pancreatic tissue from intermittent hypoxia-induced damage by promoting the antioxidant response mediated by the Nrf2-ARE signaling pathway. 　　Key words：Ginkgo biloba extract;Intermittent hypoxia;Nrf2/ARE signaling pathway;Oxidative stress;Pancreatic tissue
　　阻塞性睡眠呼吸暫停综合征（obstructive sleep apnea syndrome，OSAS）已被证明与胰岛素分泌紊乱、胰岛素抵抗和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）有关。尽管有研究显示，间歇性低氧（intermittent hypoxia，IH）在OSAS中可能通过氧化应激加重胰腺组织的损伤，进一步促进T2DM的发生发展，但其作用机制尚不清楚。研究发现[1，2]，Nrf2-ARE信号通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，调控体内氧化还原水平，是机体抵御各种氧化应激的重要保护通路。银杏叶提取物（extract ginkgo biloba，EGB）是从银杏叶中分离纯化的活性物质，含有24%的黄酮苷和6%的萜内酯，具有降血压、改善血液循环、解除血管痉挛、抗氧化等生物学活性，是一种有效的抗氧化剂可抑制炎症和氧化应激。本研究旨在探讨间歇性缺氧所致胰腺组织损伤的潜在机制，并在此基础上探讨EGB 对间歇性低氧所致胰腺损伤中的作用。
　　1材料和方法
　　1.1实验动物  Nrf2基因敲除型小鼠（Nrf2-/-）（Johns Hopkins University）54只，鼠龄 6～8 周龄，体质量（20±2）g。同遗传背景清洁级C57BL/6雄性野生型（WT）小鼠54只。动物饲养于实验动物中心，相对湿度为50%～60%，室温（24±3）℃，昼夜节律光照。在实验过程中喂食标准的鼠粮和饮用水。所有动物实验方案均经当地伦理委员会批准，并根据《实验动物的护理和使用指南》进行研究。
　　1.2主要试剂及仪器  Nrf2（核因子E2相关因子2）、HO-1（血红素加氧酶-1）、γ-GCS（γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶）、NQO1（苯醌氧化还原酶1）单克隆抗体（美国abcam公司）;小鼠β-actin抗体、辣根酶标记抗鼠IgG二抗、辣根酶标记抗兔IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）;EGB761（ 金纳多，德国 Schwabe 制药集团）;超敏ECL发光试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）;逆转录试剂盒：（天根生化科技<北京>有限公司）;全自动低氧动物舱（型号：JXOC-12 型）;低温高速离心机5804R型（Eppendorf公司）;紫外分光光度计（日本 Shimadzu 公司）;CFX96实时荧光定量PCR仪（美国伯乐公司）。
　　1.3动物分组、制备慢性间歇性低氧模型及给药  健康C57BL/6雄性野生型小鼠、Nrf2基因敲除型雄性小鼠各54 只，按随机数字表法分为常氧对照组 1、2，间歇性低氧组 1、2，Nrf2 激活剂组，抗 Nrf2 抗体组，EGB低、中、高浓度组，每组6只。所有小鼠适应性饲养1周后开始制备慢性间歇性低氧模型，除常氧对照组在常氧条件下饲养外，其余各组小鼠置于低氧舱内，向舱内循环通入氮气和氧气，30 s充入氮气，使最低氧浓度达 4%～6% ，保持 20 s，随后20 s充入氧气，使氧浓度恢复至21%，保持40 s，8 h/d，其余时间置饲养笼，在空气、室温条件下正常饮食，对照组给予空气常氧对照。造模10周后开始干预，常氧对照组1及间歇性低氧组1腹腔注射生理盐水   1 ml/d，Nrf2 激活剂组腹腔注射Nrf2激活剂莱菔硫烷5 mg/（kg·d），抗 Nrf2 抗体组腹腔注射抗 Nrf2 抗体。常氧对照组2及间歇性低氧组2以10 mg/（kg·d）生理盐水灌胃，EGB 低、中、高浓度组分别按50、100、200 mg/（kg·d）的EGB剂量灌胃。
　　1.4提取小鼠的胰腺组织  药物干预10周末，提取小鼠的胰腺组织。小鼠禁食12 h后称重，用7%的水合氯醛以0.1 ml/10g的剂量腹腔注射麻醉小鼠，酒精消毒皮肤后打开腹腔，迅速取下整个胰腺组织，并将其分成几片，用冰生理盐水漂洗，将这些小的胰腺组织碎片分装放入1.5 ml的去酶EP管中，一管装有1 ml RNAhold溶液，4℃过夜，-20℃贮存备用，另一管迅速放入液氮中速冻，-80℃贮存备用。
　　1.5蛋白质印迹分析胰腺组织中Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS的蛋白表达  将冷冻的胰腺组织倒入含有液氮的研钵中充分研磨，然后浸入含有1%PMSF的RIPA裂解缓冲液中裂解，并在冰上静置30 min，在4°C下以12000 r/min离心15 min，收集上层液，并用BCA蛋白测定方法进行总蛋白定量，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）电泳90 min，然后将电泳产物转移到PVDF膜上，将膜在室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h，TBST洗膜3次，10 min/次，滴加一抗（1∶1000），4℃缓慢摇动孵育过夜。TBST洗膜3次，10 min/次，然后滴加二抗（1∶5000），室温下孵育 2 h，TBST洗膜3次，10 min/次。将ECL化学发光液与膜孵育3 min，用吸水纸吸净液体后，用保鲜膜将膜包裹，放入夹板中。在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1 min。显影、水洗、定影。Image J软件用于数据分析。
　　1.6实时定量聚合酶链反应  检测胰腺组织中Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS的mRNA水平，应用TRIzol法提取胰腺组织总mRNA。按照TIANGEN逆转录试剂盒的操作步骤将RNA逆转录为cDNA，所得cDNA用于后续实时荧光定量反应。使用Power SYBR Green PCR Master Mix和CFX96实时荧光定量PCR仪进行PCR反应。将GAPDH用作Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS标准化的内部对照。引物合成序列如下：GAPDH正向引物：5′-TATGTCGTGGAGTCTACTGGT-3′，反向引物：5′-GAGTTGTCATATTTCTCGTGG-3′;Nrf2正向引物：5′-ACAGTGCTCCTATGCGTGAA-3′，反向引物：5′-TCTGGGCGGCGACTTTAT-3′;HO-1 正向引物：5′-CCCAAAACTGGCCTGTAAAA-3′，反向引物：5′-CGTGGTCAGTCAACATGGAT-3′;NQO1 正向引物：5′-AGGATGGGAGGTACTCGAATC-3′，反向引物：5′-AGGCGTCCTTCCTTATATGCTA-3′;γ-GCS：正向引物：5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′，反向引物：5′-CAGGACAGCCTAGTCTGGGGAA-3′。相对基因表达采用2-△△Ct的方法显示，每个PCR反应都进行3个复孔，重复3次实验。 　　1.7统计学分析  使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，符合正态分布的数据以（x±s）表示，行Student t检验，多组间比较时使用单因素方差分析（ANOVA），非正态分布的数据使用非参数检验。P<0.05认为差异有统计学意义，P<0.01表示统计学意义显著。使用GraphPad Prism 5.0绘制图形。
　　2结果
　　2.1各组野生型雄鼠胰腺组织中Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS蛋白表达情况  与常氧对照组比较，间歇性低氧组 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表达降低（P<0.05）;与间歇性低氧组1比较，Nrf2 激活剂组 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表达升高，抗 Nrf2 抗体组则相反（P<0.05）;与间歇性低氧组2比较，EGB低浓度组γ-GCS 表达升高（P<0.05），EGB中、高浓度组 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表达均升高（P<0.05），且EGB高浓度组 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表达均高于EGB中浓度组（P<0.05），见图1。
　　2.2各组Nrf2基因敲除型雄鼠胰腺组织中Nrf2、HO-1、NQO1、γ-GCS蛋白表达比较  间歇性低氧组Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS 表达与常氧对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）;与间歇性低氧组1比较，Nrf2 激活剂组 HO-1表达升高（P<0.05）; EGB低浓度组 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCS表达与间歇性低氧组2比较，差异无统计学意义（P>0.05）;EGB中浓度组NQO1、γ-GCS 表达升高（P<0.05），EGB高浓度组HO-1、NQO1、γ-GCS 表达升高（P<0.05），见图2。
　　2.3各组野生型雄鼠胰腺组织 Nrf2-ARE 信号通路相关基因表达情况  与常氧对照组比较，间歇性低氧组Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCSmRNA表达降低（P<0.05）;与间歇性低氧组1比较，Nrf2激活剂组 Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCSmRNA表达均升高，抗Nrf2抗体组则相反（P<0.05）;与间歇性低氧组2比较，EGB低、中浓度组Nrf2和HO-1mRNA表达降低，NQO1和γ-GCSmRNA表达升高（P<0.05）;EGB高浓度组Nrf2、HO-1、NQO1和γ-GCSmRNA表达升高（P<0.05），见图3。
　　2.4各组敲除型雄鼠胰腺组织 Nrf2-ARE 信号通路相关基因表达情况  与常氧对照组比较，间歇性低氧组HO-1mRNA表达降低（P<0.05）;与间歇性低氧组1比较，Nrf2激活剂组HO-1mRNA表达升高，抗Nrf2抗体组HO-1mRNA表达降低（P<0.05）;与间歇性低氧组2比较，EGB低浓度组HO-1和γ-GCS mRNA表达升高（P<0.05）;EGB中浓度组 NQO1、HO-1和γ-GCS mRNA表达升高（P<0.05）;EGB高浓度组HO-1和γ-GCS mRNA表达升高（P<0.05），见图4。
　　3讨论
　　OSAS是一种广泛存在的临床疾病，在2型糖尿病患者和相关代谢条件中非常普遍[3]。基于累积的临床流行病学证据，OSAS可影响葡萄糖代谢，诱导胰岛素抵抗，促进2型糖尿病的发展[4-6]。有研究显示[7]，在慢性间歇性低氧模型中，慢性间歇性低氧可导致氧化应激水平升高，出现高胰岛素血症，血糖升高及胰岛功能受损，造成胰腺组织损伤，导致糖代谢紊乱，产生胰岛素抵抗。此外，研究还发现OSAS患者的抗氧化能力降低[8]。因此，Nrf2-ARE信号通路是否参与了保护间歇性低氧所致的胰腺损伤仍尚待阐明。本研究通过体内实验研究了这种损伤效应，并探讨了其潜在机制，结果表明，间歇性低氧可导致下游蛋白（HO-1，NQO1和γ-GCS）表达降低，且与Nrf2基因敲除型小鼠比较，间歇性低氧可进一步加剧基因敲除型小鼠胰腺组织的损伤，尽可能地减轻这种协同损伤，具有重要的临床意义。
　　银杏叶提取物可作为一种有效的自由基清除剂，通过增强抗氧化酶活性，減轻活性氧和脂质过氧化的过度积累，具有抗氧化应激的保护作用[9]。本研究假设胰腺组织损伤后EGB的保护作用是由Nrf2-ARE信号通路介导，为证实该假设，本研究在间歇性低氧模型中用不同剂量的EGB测试了Nrf2-ARE信号通路的变化。Western blot和RT-PCR分析表明EGB增强了间歇性低氧后胰腺组织中Nrf2的表达，并激活了下游蛋白（HO-1，NQO1和γ-GCS），Nrf2-ARE信号通路被激活以在间歇性低氧模型中发挥保护作用，并且这些作用是通过抑制氧化应激引起的损伤来介导的。因此，得出银杏叶提取物在间歇性低氧胰腺组织中的保护作用是通过激活Nrf2-ARE信号通路来介导的结论。
　　综上所述，间歇性低氧导致的氧化应激是OSAS的主要病理生理机制，Nrf2-ARE 信号通路能调节氧化应激及炎症因子水平，改善胰岛功能，减轻胰腺组织损伤和抑制氧化应激来改善间歇性低氧后的继发性胰腺损伤。银杏叶提取物通过促进Nrf2-ARE信号通路介导的抗氧化反应，保护胰腺组织免受间歇性低氧诱导的损伤。EGB可通过抑制炎症反应和氧化应激减轻IH诱导的胰腺损伤，促进Nrf2-ARE信号通路参与了EGB的保护机制。这项研究可能为EGB作为治疗OSAS患者的潜在药物提供证据。
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　　收稿日期：2019-10-15;修回日期：2019-10-25
　　编辑/肖婷婷
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