绿茶蛋白质的提取及抗氧化肽的制备研究
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作者:张子迪 李宜慧 朱彩霞 杨薇 白东清 李涛
摘要 [目的]对茶叶蛋白质的最佳提取条件进行研究，并研究茶叶蛋白酶解产物的抗氧化性，为茶叶的高附加值利用提供思路。[方法]采用超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质，采用响应面法进行茶叶蛋白提取工艺的优化。将茶叶蛋白采用风味蛋白酶进行水解，获得具有抗氧化活性的茶叶多肽。[结果] 通过响应面法得到茶叶蛋白的最佳理论提取条件：提取时间120 min，提取温度59.02 ℃，碱液浓度0.65 mol/L，料液比1∶20。在此条件下，预测得到的茶叶蛋白质最大提取量为29.79%，经过验证后，茶叶蛋白的最大提取量达到28.39%。利用风味蛋白酶酶解茶叶蛋白获得具有较强抗氧化能力的多肽混合物，酶解的最佳条件为：酶解时间 60 min， 酶解温度60 ℃，酶解pH 7.0， 酶用量 9%。[结论]该研究开发了一种茶叶蛋白的提取工艺，并且茶葉蛋白可以通过风味蛋白酶酶解制备绿色、天然的抗氧化剂。
关键词 茶;蛋白提取;抗氧化性;响应面优化
中图分类号 TS272.5+1文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2020）07-0202-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.058
Study on the Extraction of Protein from Green Tea and Preparation of Antioxidant Peptides
ZHANG Zidi，LI Yihui，ZHU Caixia et al
（College of Basic Science， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384）
Abstract [Objective] To study the optimum extraction conditions of protein from tea and investigate the antioxidant property of the enzymatic hydrolysates of tea protein， so as to provide a new perspective for the high addedvalue development of tea protein. [Method] The ultrasoundassisted alkali method was used for the extraction of tea protein， and the extraction process was also optimized through the response surface methodology. The antioxidant tea peptides were obtained by hydrolyzing the purified tea protein with flavor protease. [Result]The predicated optimum conditions for the extraction of tea protein were as follows： extraction time of 120 min， extraction temperature of 59.02 ℃， alkali concentration of 0.65 mol/L， and material/solvent ratio of 1∶20. The predicted maximum protein extracted yield was 29.79% under these conditions. The actual yield of extracted tea protein was 28.39% after verification by experiment. The peptides which were obtained by hydrolyzing the tea protein using flavourzyme demonstrated good antioxidant property. The optimum enzymatic hydrolysis conditions getting from single factor experiment were： the reaction time of 60 min， the reaction temperature of 60 ℃， the pH value of 7， and the dosage of flavourzyme of 9%. [Conclusion]We successfully developed a new extraction method for the tea protein， and studied the antioxidant property of the enzymatic hydrolysates of tea protein. The results showed that it could be developed to a kind of green natural antioxidant. Key words Tea;Protein extraction;Antioxidant;Response surface methodology
基金项目 天津市高等学校大学生创新创业训练计划项目（200810061098）。
作者简介 张子迪 （1998—），女，天津人，专业：生物制药。通信作者，讲师，博士，从事天然活性多肽方面的研究。
收稿日期 2019-12-29
茶为山茶科山茶属常绿灌木或小乔木植物，主要分布于中国、印度、印度尼西亚、斯里兰卡、肯尼亚等热带和亚热带地区。茶最早被人们认知是因其药用价值。《神农本草經》中有记载“神农尝百草，日遇七十二毒，得茶而解之”;同样唐代陈藏器编写的《本草拾遗》中也有“诸药为各病之药，茶为万病之药”的记载。
茶叶中成分复杂，其中有机化合物的比例最高，约450种，占茶叶鲜重的15%～21%。茶叶中的主要有机物为茶多酚（20%～35%）、蛋白质（20%～30%）、多糖（20%～25%）、脂肪（约8%）、生物碱（2%～5%），有机酸（约3%）、维生素（0.6%～1.0%）等[1]。目前茶多酚的成分及功效研究的比较深入，主要是一系列含有2-苯基苯并吡喃结构的类黄酮类物质，是茶叶中的主要功能保健成分。研究表明茶多酚具有清除人体内自由基[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]、抗肿瘤[5]、调血脂[6]、防治动脉粥样硬化[7]方面都有明显效果。
茶叶中的蛋白质含量仅次于茶多酚的量，其蛋白质组成为82.05%的谷蛋白和13.61%的醇溶蛋白[8-9]。除了具有营养品质，这些茶叶蛋白质还可以较强的清除氧自由基。大部分的茶叶蛋白易溶于碱不溶于水，是大部分茶叶蛋白质所具备的特征[8-9]。碱液对蛋白质的氢键很有破坏作用，并且蛋白质的极性基团，在碱液中会发生解离，那么蛋白质的表面就会具有相同的电荷，这样蛋白质分子的溶解就会增多，提取率也就提高了[10-11]。
蛋白质在酶的作用下，能够水解生成有抗氧化性的酶解产物，会产生多肽片段，这些多肽片段具有强抗氧化作用[12]，这是蛋白酶解产物具有较强抗氧化作用的主要原因。酶解蛋白制备抗氧化肽也是目前获得此类抗氧化多肽的重要方法。笔者从茶叶综合利用的角度出发，对茶叶中的蛋白的提取工艺进行优化，并进行了茶叶蛋白酶法制备抗氧化肽的研究，以期为茶叶废弃物的资源化利用提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 茶叶蛋白提取的单因素试验 将市售的绿茶叶放入小型高速粉碎机中粉碎，过70目筛，制成茶叶粉，待用。
1.1.1 提取时间对茶叶蛋白质提取率的影响。
称取茶叶粉1 g放入50 mL的离心管中，按照料液比为1∶40（m/V，g∶mL）加入0.5 mol/L NaOH 溶液，并在2 000 r/min转速下搅拌均匀分散，50 ℃下超声波辅助提取60、75、95和120 min。茶叶提取混合液离心10 min（10 000 r/min，4 ℃）。将上清液稀释到合适的倍数后，检测蛋白质的含量，计算提取的茶叶蛋白占茶叶干重的百分含量。
1.1.2 提取温度对茶叶中蛋白质提取率的影响。
称取1 g茶叶粉，按照料液比为1∶40（m/V）加入0.5 mol/L NaOH 溶液，混合均匀，分别在50、60、70和80 ℃条件下进行超声波辅助提取茶叶蛋白质，采用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，计算提取的茶叶蛋白占茶叶干重的百分含量。
1.1.3 碱液浓度对茶叶蛋白质提取的影响。
称取1 g茶叶粉，按照料液比为1∶40（m/V）分别加入0.15、0.30、0.50和0.70 mol/L NaOH 溶液，在50 ℃下超声波辅助提取60 min，测量提取液中蛋白质的含量，并计算提取的茶叶蛋白占茶叶干重的百分含量。
1.1.4 料液比对茶叶蛋白质提取的影响。
称取1 g茶叶粉，提取温度为50 ℃，提取时间为60 min，碱液浓度为0.5 mol/L，分别在料液比（m/V）为1∶20、1∶30、1∶40和1∶50条件下进行超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质，测量提取液中蛋白质的含量，计算提取的茶叶蛋白占茶叶干重的百分含量。
1.2 响应面法优化茶叶蛋白的提取工艺
根据超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质的单因素试验结果，选择提取时间、提取温度、碱液浓度和料液比4个因素为响应面设计中的关键因素，以茶叶蛋白质提取率为响应值，进行Box-Behnken的中心组合试验方案的设计。应用Design-Expert8.05b软件，对试验数据进行回归分析，建立茶叶蛋白质提取率与设计因素的回归模型，对超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质的提取率进行预测分析;对模型进行回归方差分析显著性检验，确定各因素对茶叶蛋白质提取率的影响规律，分析各因素间交互作用，绘制影响因素的响应面图，根据回归模型确定茶叶蛋白的最佳提取工艺，并进行验证。
1.3 茶叶蛋白质的分离与纯化
根据响应面分析法优化所得到的最佳提取条件，进行茶叶蛋白质的提取。蛋白提取液冷却至室温后，用HCl调节pH至7.0，在10000 r/min条件下，离心10 min，收集上清液，并按提取液：无水乙醇（1∶5，V/V），的比例加入冰乙醇，放入4 ℃的冰箱静置1 h。然后将沉淀混合液在10 000 r/min条件下，离心10 min，离心完成后，弃去上清液，收集沉淀蛋白，并用0.1 mol/L、pH 7.4 的PBS溶液将沉淀蛋白进行溶解，得到茶叶蛋白质的粗提液。将茶叶粗蛋白采用葡聚糖凝胶Sephadex G-25层析柱分离纯化，流速为0.3 mL/min，洗脱液每管收集3 mL，并测量在280 nm处的吸光度值，绘制出洗脱曲线。将收集到的茶叶蛋白溶液进行冷冻干燥，得到茶叶蛋白粉。 1.4 茶叶蛋白的酶解及酶解产物抗氧化活性的检测
1.4.1 酶解时间对茶叶蛋白酶解产物抗氧化活性的影响。
将纯化后的茶叶蛋白用0.1 mol/L、pH 7.0的PBS 缓冲液溶解，按底物蛋白的10%的比例加入风味蛋白酶，酶解温度为60 ℃，酶解时间分别为30、45、60和75 min。反应结束后，采用连苯三酚自氧化法测定茶叶多肽的抗氧化活性，确定酶解时间对茶叶蛋白酶解产物抗氧化性的影响。
1.4.2 酶解温度对茶叶蛋白酶解产物抗氧化活性的影响。
将纯化后的茶叶蛋白用0.1 mol/L、pH 7.0 的PBS缓冲液溶解，按照底物蛋白的10%的比例加入风味蛋白酶，反应时间为60 min，在40、50、60和70 ℃条件下进行酶解反应，检测酶解产物的抗氧化活性，确定反应温度对酶解产物抗氧化性的影响。
1.4.3 pH对茶叶蛋白酶解产物抗氧化性的影响。
将纯化后的茶叶蛋白用不同pH的缓冲液进行溶解（pH 5.7、6.5、7.0、7.5），按照底物蛋白的10%的比例加入风味蛋白酶，反应时间为60 min，检测酶解产物的抗氧化活性， 分析pH对酶解产物抗氧化性的影响。
1.4.4 酶用量对茶叶蛋白酶解产物抗氧化性的影响。
将纯化后的茶叶蛋白用0.1 mol/L、pH 7.0 的PBS缓冲液溶解，反应时间为60 min，反应温度为60 ℃，酶用量分别为底物蛋白的2%、4%、6%、8%和10%。酶解反应结束后，进行产物抗氧化性的测定，分析酶用量对茶叶蛋白酶解产物抗氧化性的影响。
1.5 蛋白浓度的测定
根据BCA 蛋白浓度测定试剂盒（增强型）要求，将试剂A与试剂B以50∶1的比例配制成工作液。配制0.5 g/mL 标准蛋白溶液。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入96 孔平板中，加入蒸馏水稀释至20 μL。各孔加入200 μL的BCA 工作液，37 ℃放置30 min。用酶标仪在562 nm波长下测定吸光度，然后以标准蛋白浓度、吸光度分别对应于横、纵坐标来绘制标准曲线。取20 μL样品溶液加入BCA工作液200 μL，37 ℃保温30 min。在562 nm波长下测定吸光度，并根据标准曲线计算出样品浓度。
1.6 抗氧化活性的測定[13]
取3 mL的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），在325 nm处进行空白调零后，取2.95 mL的Tris-HCl溶液，加入50 μL 60 mmol/L的连苯三酚溶液，迅速颠覆式混合，倒入石英比色皿中，在325 nm处记录反应进行30和300 s时的吸光度（A值），得△A=A300s-A30s， 记为△A0;取2.90 mL的Tris-HCl溶液，加入50 μL的上清液，再加入50 μL 60 mmol/L的连苯三酚溶液，迅速颠覆式混合，分别在30和300 s时测量在325 nm处的吸光度（A值），得△A=A300s-A30s 记作△A样，则样品对自由基的清除率按以下公式计算：清除率=（△A0-△A样）/△A0×100%。
2 结果与分析
2.1 超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质
2.1.1 提取时间对超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质提取率的影响。由图1可知，当提取时间为60～95 min时，随着时间的增长，蛋白质提取率提高，而提取时间继续延长（120 min），茶叶蛋白的提取量有小幅下降。提取时间为95 min时，蛋白质提取率达到最大值15.03%，表明在提取时间为95 min时，大部分茶叶蛋白质都已经完全溶解于提取液中。
2.1.2 提取温度对超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质提取率的影响。由图2可知，
随温度的升高，蛋白质提取率提高，在60 ℃时蛋白的提取量达到最大值（18.2%），随着温度的继续升高，蛋白质提取率有所下降。由于蛋白质在高温的条件下容易变性，甚至降解[14]。为了降低高温对茶叶蛋白质的不利影响，并且节约能耗，选择60 ℃为最佳提取温度。
2.1.3 碱液浓度对超声波辅助碱法提取茶叶中蛋白质提取率的影响。由图3可知，
随着碱液浓度的增大，蛋白质提取率提高，碱液浓度为0.5 mol/L 时，茶叶蛋白的提取量达到最大，随着碱液浓度的增大，蛋白质提取量有所下降。在碱液浓度为0.5 mol/L时，蛋白质提取率达到最大为16.27%，说明大部分茶叶蛋白质在浓度为0.5 mol/L的碱液中被溶出。
2.1.4 料液比对超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质提取率的影响。由图4可知，
当料液比为1∶20～1∶40时，随料液比的增大，蛋白质提取率逐渐提高，而随着料液比的继续增大，蛋白质提取率有少量下降。由于料液比太大，在提取后会造成废水处理的负担，并会使提取液中的蛋白质浓度偏低，这样会造成蛋白质难以絮凝沉淀，所以在单因素条件下料液比以1∶30最佳。 2.2 响应面分析法优化茶叶蛋白提取工艺条件
2.2.1 响应面试验设计。
根据BoxBehnken的中心组合试验设计原理，综合单因素试验的结果，选取提取时间 （A）、提取温度（B）、碱液浓度（C）和料液比（D）4个因素，采用4因素3水平的响应面分析方法进行优化分析，试验因素和水平见表1。
2.2.2 响应面分析法优化试验结果。
选择Box-Behnken中心组合试验模型，进行4因素3水平的响应面分析试验，共有29个试验点。试验点可以分为2类，一类是析因点，共有24个，是自变量的取值在4个因素所构成的三维顶点;另一类是区域的中心点，中心点试验需要重复5次，是为了估算试验误差。最后的影响值是茶叶蛋白质提取量。BoxBehnken试验设计及结果见表2。
利用Design-Expert 8.05b软件对试验数据进行回归分析，得到蛋白质提取率对以上4个因素的二次多项式回归模型： 茶叶蛋白提取量=22.89-0.50A-2.17B+3.62C+3.06D+1.69AB+1.75AD+0.65BC-0.85BD+3.59CD+2.18A2-4.10B2-4.30C2-2.64D2。
对该回归模型进行方差分析，结果如表3所示。该回归方程在描述4个因素和响应值的关系时，二次多项回归模型显著，但各因素对蛋白质提取率的影响不是简单的线性关系。二次多项回归模型的一次项C（碱液浓度）、D（料液比）极其显著，B（提取温度）显著;二次项B2（提取温度）、C2（碱液浓度）极其显著;交互项CD显著。根据二次多项式回归方程各项的方差分析结果，可以看出方程的失拟项较小，表明该方程对试验拟合情况好、误差小，得到的二次多项回归模型可以较好的分析和预测茶叶蛋白质的提取率。
提取时间与提取温度、提取时间与碱液浓度、提取时间与料液比之间的交互作用不显著;碱液浓度和料液比之间交互作用较显著，其响应面交互作用情况如图5所示。
根据响应面优化得到的模型方程，预测提取的茶叶蛋白的最高量可以达到29.80%，达到该最高值的条件：提取时间120 min，提取温度59.02 ℃，碱液浓度0.65 mol/L，料液比1∶20。为了检验响应面分析法得出的茶叶蛋白质提取率模型的合适性和有效性，需要在最佳条件下进行三组验证试验，考虑到实际情况，提取温度定为60 ℃，提取时间为120 min，碱液浓度0.65 mol/L，料液比1∶20，得到蛋白质提取率的试验平均值为28.39%，与模型预测值29.80%的差值仅占预测值的4.73%，这充分说明了该模型可以较好的分析和预测超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质的提取率。
2.3 茶叶蛋白质的分离与纯化
将提取所得蛋白溶于PBS溶液中，用葡萄糖凝胶Sephadex G-25层析柱，进行凝胶过滤层析法分离纯化。根据图6的蛋白质的洗脱峰进行收集洗脱液，收集第10管到38管间的洗脱液，合并并进行冷凍干燥，从而得到纯化了的绿茶蛋白质粉末。
2.4 茶叶蛋白酶解产物抗氧化活性分析
2.4.1 反应时间对酶解产物抗氧化性的影响。由图7可知，
当反应时间 30～60 min时，随着酶解反应时间的增长，茶叶蛋白酶解产物自由基清除率不断上升;当反应时间为60～75 min时，随着反应时间的增长，自由基清除率稍有下降。因此选定60 min为最适酶解反应时间，自由基的清除率为 48.2%。
2.4.2 反应温度对酶解产物抗氧化性的影响。由图8可知，
当酶解反应温度为40～60 ℃时，随着反应温度的升高，自由基清除率不断上升，而反应温度在60～70 ℃时，随着反应温度的升高，超自由基清除率下降明显，说明温度升高，对风味蛋白酶活性的影响很大。这是因为在风味蛋白酶酶解蛋白质的过程中，反应效率受温度的影响主要表现在以下2个方面：一方面是对风味蛋白酶催化反应速率的影响，另一方面则是对风味蛋白酶稳定性的影响。在一定的范围内升高温度，会使蛋白质酶解的速度加快，即酶解效率被提高。但是当温度超过一定的限度，过高温度会造成酶分子的变性，那么风味蛋白酶的稳定性会降低，这样酶解的效率就会下降[15]。因此，选定60 ℃为酶解反应温度。
2.4.3 pH对酶解产物抗氧化性的影响。由图9可知，当酶解反应体系的pH 为7.0时，茶叶蛋白酶解产物对自由基清除能力达到最高值（52.1%）。当pH为7.5时，酶解产物的抗氧化能力最低，可能在弱碱性环境中，就会造成风味蛋白酶分子的构象的改变，造成酶解效率的降低。因此，选定pH 7.0为茶叶蛋白酶解制备抗氧化肽的反应pH。
2.4.4 酶量对酶解产物抗氧化性的影响。由图10可知，当酶量为3%～9%时，随着酶量的增大，茶叶蛋白酶解产物的自由基清除率不断上升;当酶量为9%～12%时，酶量的增加对超氧自由基清除率的影响基本保持不变。基于成本方面的考虑，增加酶量，就意味着成本的增加。因此希望用酶量尽量少，同时保证得到的酶解产物较高的抗氧化能力，并发挥酶的最大催化作用，避免造成浪费 [16]。由于酶量是底物蛋白质的9%～12%时，呈现趋势基本稳定，考虑到成本问题，因此选定9%为最佳反应酶量。
3 结论
通过对茶叶蛋白质提取条件的研究，进行了单因素试验，并采用响应面法优化了茶叶蛋白质的提取条件。 根据模型预测当提取时间为120 min，提取温度是59.02 ℃，碱液浓度为0.65 mol/L，料液比为1∶20时，预测得到的茶叶蛋白最大提取产量为29.79%，而验证结果表明在此条件下蛋白质提取率的试验平均值为28.39%，与模型预测值29.80%的差值仅占预测值的4.73%，充分说明了该模型可以较好的分析和预测超声波辅助碱法提取茶叶蛋白质的提取率。 造成偏差原因可能是实际提取试验中，超声波提取装置会在超声过程中升温，造成温度的变化，温度对实验结果的影响又很大，所以才会略有出入。提取的茶叶蛋白质经过风味蛋白酶酶解后，酶解产物具有较高的超氧自由基清除率，该试验结果表示茶叶蛋白质的酶解产物有很好的抗氧化性，可以被应用于食品产业，来开发一种新型、绿色、天然的抗氧化剂。 参考文献
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