胶原蛋白肽的制备

作者:未知

  摘要    为了获取分子量较小、皮肤角质层易吸收的胶原蛋白肽,本文以新鲜猪皮为原料,用碱性蛋白酶水解方法制备胶原蛋白肽。结果表明,通过提取制备的猪皮胶原蛋白肽样品显示为淡黄色,而且猪皮的应用效率较高。
  关键词    猪皮;胶原蛋白肽;制备方法
  中图分类号    TS251.92        文献标识码    A        文章编號   1007-5739(2019)06-0220-01
  猪皮,又名猪肤,东汉名医张仲景在《伤寒论》中曾详细记载了猪皮具有活血止血、补益精血、滋润肌肤、光泽头发、减少皱纹、延缓衰老的作用。猪皮中的蛋白质含量比较高,可以达到33%,其中胶原蛋白含量占总蛋白量的87.8%[1]。胶原蛋白由于特殊复杂的空间结构,其分子量高达300 kDa[2],很难被机体吸收,通过蛋白酶水解可以将猪皮中的蛋白质水解为肽,其反应温和,产品安全,适用于功能食品、化妆品及其他健康相关产品[3]。同时,胶原蛋白的化学组成、结构赋予了其独特的生理活性,可发挥美白、保湿、防皱、修复、营养、减肥等美容美体作用[4]。胶原蛋白经水解后,其功能特性和生理活性功能将会被改善。胶原蛋白水解产物分子量的分布、疏水性的大小、极性的强弱等主要受水解过程的影响,从而影响胶原蛋白肽的活性功能[5]。研究表明,胶原蛋白肽的分子量一般在1~3 kDa时,其抗氧化活性、抑制皮肤黑色素生成、延缓皮肤老化和抑制紫外线损伤等功效是比较显著的[6]。
  我国猪皮生物资源极为丰富,本研究以新鲜猪皮为原料,采用碱性蛋白酶酶解法提取分子量相对较小、皮肤角质层易吸收的胶原蛋白肽,并验证其对皮肤的美容保湿等功效。
  1    材料与方法
  1.1    试验材料
  猪皮,购于杨凌好又多雨润专卖店。
  1.2    试剂与仪器
  试剂:碱性蛋白酶(8 500 u/g)为还原型谷胱甘肽,购于美国sigma公司;食用碱面(食品级);三氯乙酸、氯化钠,均为分析纯。
  仪器:UV-2450型紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司);RE-52AA型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);H1650型离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);HH-S4型电热恒温水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)。
  1.3    试验方法
  1.3.1    胶原蛋白肽的提取。提取流程:新鲜猪皮→剔脂→洗涤→切碎→回流→酶水解→灭酶活→离心分离→真空抽滤→蒸发浓缩→胶原蛋白肽浓缩液。具体操作步骤:①选取皮下脂肪含量少、皮质较透明的新鲜猪皮作为原料,将猪皮去污,刮去毛根,剔除皮下脂肪,切成3 mm×3 mm左右的小块,用40 ℃的蒸馏水清洗2次。②将处理后的猪皮装于锥形瓶中加入2%NaCl(猪皮与2% NaCl的质量体积比为1∶8),于常温下放置8 h,取出猪皮中的杂蛋白。③按猪皮重量的7倍加入蒸馏水,升温至100 ℃回流蒸煮1 h。④将回流后的猪皮加液体冷却至55 ℃,加入0.2%食用碱面调节pH值为7.5,加入猪皮重量3%的碱性蛋白酶,放入恒温水浴锅中酶解12 h。⑤酶解完成后,将其放入95 ℃的恒温水浴锅中保持15 min以上,将酶灭活。⑥冷却后,液体离心20 min 4 000 r/min,分离脂肪层及未酶解的猪皮。⑦将酶解液真空抽滤,用旋转蒸发器50 ℃浓缩以得到猪皮胶原蛋白肽浓缩液,浓缩至原液体积的1/3。⑧将猪皮胶原蛋白肽浓缩液放于-20 ℃的冰箱中储藏备用。
  1.3.2    GSSH标准液的制备。称取100 mg GSSH,用蒸馏水在100 mL容量瓶中溶解并定容至刻度。然后移取0、3、4、5、6、7、8 mL上述溶液于10 mL具塞试管中,分别用5%的TCA定容至刻度。此标准溶液的GSSH质量浓度分别是0、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/mL。
  1.3.3    GSSH标准曲线的绘制。分别移取标准液6 mL于10 mL离心管中,再分别加入4 mL双缩脲试剂,充分混匀。静置20 min,2 000 r/min离心10 min,于540 nm下测定ABS值。
  1.3.4    胶原蛋白肽含量的测定。取2.0 mL样品溶液,加入等量10% TCA溶液,将其混合均匀(稀释2倍),静置10 min,4 000 r/min离心15 min,吸取上清液0.5 mL至10 mL容量瓶中,并用5% TCA定容至刻度(稀释20倍),充分摇匀,然后取6.0 mL上述溶液于另一试管中(3次重复),加入双缩脲试剂4.0 mL,混合均匀,静置20 min,2 000 r/min离心10 min,在540 nm下测定ABS值,以GSSH质量浓度为0 mg/mL的处理作空白对照,对照GSSH质量浓度-ABS值标准曲线,求得样品溶液中的多肽浓度,再乘以稀释倍数(共稀释40倍),即可求得样品的多肽含量。
  2    结果与分析
  通过标准曲线法测定酶解液中肽的浓度,由图1可知,其回归方程为y=9.161 8x,相关系数R2=0.995 1。按上述方程计算猪皮酶解液中胶原蛋白肽的浓度为88.68 mg/mL。
  3    结论
  本试验制得的猪皮胶原蛋白肽样品为淡黄色,经碱性蛋白酶在55 ℃酶解12 h后,猪皮基本消失,猪皮的应用效率较高。通过GSSH曲线的绘制,测定猪皮酶解液中胶原蛋白肽的浓度为88.68 mg/mL。所制得的胶原蛋白肽样品用三氯乙酸来沉淀蛋白,经离心,未发现蛋白沉淀,说明制得的胶原蛋白肽分子量相对较小,达到了本试验对胶原蛋白肽的要求。
  4    参考文献
  [1] 胥彩云,童军茂,周晓宏.胰酶水解猪皮胶原蛋白及其产物氨基酸分析[J].食品研究与开发,2010,3l(9):34-36.
  [2] 臧盛,张立娟,卢进峰.猪皮胶原蛋白的研究进展[J].农产品加工,2011(11):59-62.
  [3] 李开雄,赵志远,刘霞.猪皮中胶原蛋白的提取及其应用[J].肉类研究,1996(4):43-48.
  [4] 李国英.胶原、明胶和水解胶原蛋白的性能差异[J].四川大学学报(工程科学版),2005,37(4):54-58.
  [5] 冯成利,党蕊叶,冯慧,等.胰蛋白酶水解鲜猪皮的条件选择[J].陕西科技大学学报(自然科学版),2012,30(3):23-25.
  [6] 项智锋,谢红兵.不同酶法对猪皮中提取胶原蛋白的紫外线吸收对比分析[J].光谱实验室,2008,25(6):1249-1253.
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