酶解公犊奶牛肉制备抗氧化活性肽口服液的工艺优化

作者:未知

  摘 要:为提高公犊奶牛肉的附加值,研究酶解公犊奶牛肉制备抗氧化性活性肽的最佳工艺。采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶等5 种酶对公犊奶牛肉进行酶解,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率为评价指标,筛选出酶解产物抗氧化性最高的最适蛋白酶。用最适蛋白酶对公犊奶牛肉进行酶解,通过单因素试验,研究不同酶解时间、酶解温度、酶解pH值和酶添加量对酶解产物抗氧化性的影响,然后再用响应面分析法对酶解条件进行优化。结果表明:中性蛋白酶为最佳的蛋白酶,最优酶解条件为加酶量0.61 g/100 mL、pH值6.80、酶解温度54 ℃、酶解时间2.92 h。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对酶解产物进行分析,结果表明,公犊奶牛肉中的蛋白质分子被成功水解为分子质量小于7 kDa的小分子多肽和游离氨基酸;通过感官评价方法研制出一款澄清透明、淡黄色、具有牛肉风味的抗氧化活性肽口服液。
  关键词:公犊奶牛肉;酶解;响应面分析法;抗氧化;活性肽口服液
  Abstract: For value-added utilization of veal, the meat from male dairy calves, the preparation of enzymatic hydrolysis with antioxidant activity from veal protein was optimized. Enzymatic hydrolysis was carried out by using five proteases, such as neutral protease and alcalase. To determine the optimal protease for the maximum antioxidant activity, the resulting hydrolysates were screened for 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity. Furthermore, the optimization of hydrolysis conditions including hydrolysis time, pH value, temperature and enzyme dose for improved DPPH radical scavenging activity was investigated by one-factor-at-a-time method and response surface methodology (RSM). The results showed that neutral protease was the best enzyme for the hydrolysis of beef protein. The optimal hydrolysis conditions were as follows: enzyme dose 0.61 g/100 mL, pH 6.80, temperature 54 ℃ and hydrolysis time 2.92 h. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed that protein in meat samples was successfully hydrolyzed into small peptides with a molecular mass less than 7 kDa and free amino acids. The hydrolysate prepared under the optimized conditions was used as an ingredient for formulation of an antioxidant peptide oral liquid. According to sensory evaluation, the oral liquid was clear and yellowish in color with a beef flavor.
  Keywords: veal; enzymatic hydrolysis; response surface methodology; antioxidant activity; active polypeptide oral liquid
  DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20190210-027
  中圖分类号:TS251.52                                   文献标志码:A 文章编号:1001-8123(2019)03-0026-08
  引文格式:
  何梓钰, 陈珍, 黄俊逸, 等. 酶解公犊奶牛肉制备抗氧化活性肽口服液的工艺优化[J]. 肉类研究, 2019, 33(3): 26-33. DOI:10.7506/rlyj1001-8123-20190210-027.    http://www.rlyj.net.cn
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  1 材料与方法
  1.1 材料与试剂
  本研究选用的初生公犊奶牛肉为尚未喂给饲料的初生公犊奶牛肉,由上海光明乳业牧场提供。酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及动物蛋白水解复合酶 江苏锐阳生物科技有限公司;焦糖(3%~4%)、肉类香精 湖北鑫润德化工有限公司;蜂蜜(3%~5%) 河南淮滨蜂蜜养殖基地;氢氧化钠、乙醇、盐酸及碳酸氢钠 国药集团化学试剂有限公司;所用试剂均为分析纯。
  1.2 仪器与设备
  FE20 pH计 瑞士梅特勒-托利多公司;DK-S24电热恒温水浴锅 上海华连医疗器械有限公司;UV-2000紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;3K15台式离心机 德国Sigma公司;Ag1100安捷伦液相色谱仪 美国安捷伦公司。
  1.3 方法
  1.3.1 初生公犊奶牛肉酶解工艺
  参考王玲玲[19]、成晓瑜[20]等的方法,并结合公犊奶牛的肉质特点,经过多次实验,确定出牛肉酶解液制作工艺。具体如下:初生公犊奶牛后腿肉清洗→去皮切块→绞碎成肉糜状→按比例加入水→90 ℃加热10 min,搅拌均匀→降至55 ℃→调节pH值至7.0→加入蛋白酶→匀速搅拌,恒温酶解3 h→灭酶→离心(8 000 r/min,4 ℃,10 min)→酶解产物
  1.3.2 最适蛋白酶的选择
  实验所选用的5 种蛋白酶参见表1,分别在其最适反应条件下对初生公犊奶牛肉进行酶解,酶解工艺参考1.3.1节,并测定酶解产物的DPPH自由基清除率,分析其抗氧化性。
  1.3.3 DPPH自由基清除率测定
  参考韦献雅[21]、Ozcelik[22]等的方法。准确配制质量浓度为50 g/100 mL的DPPH自由基无水乙醇溶液,室温静置10 min后,取2.5 mL加入0.5 mL待测样品溶液中,混合均匀,室温条件下避光反应20 min后,在光程为1 cm的比色皿中测定其在517 nm波长处的吸光度(Am),同时测定0.5 mL待测样品溶液与2.5 mL无水乙醇混合溶液在517 nm波长处的吸光度(An)以及0.5 mL蒸馏水与2.5 mL 0.04 mg/mL的DPPH自由基无水乙醇溶液在517 nm波长处的吸光度(A0)。每个样品平行测定3 次,结果取平均值。DPPH自由基清除率按照下式计算。式中:Am为样品溶液的吸光度;An为空白溶液的吸光度;A0为对照溶液的吸光度。
  1.3.4 酶解条件的单因素试验
  根据1.3.2节的实验结果,用筛选出的中性蛋白酶对公犊奶牛肉进行酶解,基础酶解条件:加酶量为0.30 g/100 mL、温度55.0 ℃、pH 7.0、酶解3.0 h。为了消除各因素之间的交互影响,固定其中3 个因素改变1 个因素,进行单因素试验优化。
  1.3.4.1 酶解pH值的选择
  所选用的中性蛋白酶标明的最适pH值范围为5.5~8.0。选定加酶量为0.30 g/100 mL、酶解温度55 ℃、酶解时间3 h,pH值分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,测定不同pH值条件下酶解物的DPPH自由基清除率,确定最适pH值。
  1.3.4.2 酶解温度的选择
  中性蛋白酶最适反应温度范围为40~65 ℃。选定加酶量为0.30 g/100 mL、pH值为最适值、酶解时间3 h,酶解温度分别为40、45、50、55、60、65 ℃,测定不同温度条件下酶解物的DPPH自由基清除率,确定最适温度。   1.3.4.3 加酶量的选择
  选定酶解时间3 h,pH值和温度分别为最适值,加酶量分别为0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 g/100 mL,测定酶解物的DPPH自由基清除率,确定最适加酶量。
  1.3.4.4 酶解时间的选择
  按选定的酶解pH值、酶解温度及加酶量的最佳参数,酶解时间分别为1、2、3、4、5 h,测定酶解物的DPPH自由基清除率,确定最适酶解时间。
  1.3.5 响应曲面法试验设计
  通过单因素试验确定加酶量、酶解温度、酶解时间与pH值显著影响牛肉蛋白酶解物的抗氧化能力。因此运用Box-Behnken中心组合试验设计,以pH值(A)、酶解温度(B)、加酶量(C)和酶解时间(D)为变量,DPPH自由基清除率为响应值,进行4因素3水平的响应面试验,数据采用二次多项式回归法处理。根据单因素试验结果,最适因子固定在2 个水平之间,高水平和低水平分别取最适因子的相邻值。响应面试验的因素水平设计如表2所示。
  1.3.6 SDS-PAGE分析
  参考张谦益等[23]的方法。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoeresis,SDS-PAGE),分离胶和浓缩胶分别为12%和5%;染色及蛋白质的定量参考考马斯亮蓝法[24]。
  1.3.7 活性肽口服液的制备
  按照表3配方中的比例,将获得的初生公犊奶牛肉抗氧化肽酶解液分别与白砂糖、蜂蜜、糖浆及其他配料一起加入调配罐,用搅拌器搅拌,再加入反渗透水至规定容量。过滤掉杂质后,预热至50 ℃进行均质处理,均质压力保持在20~25 MPa,连续均质2 次,防止产品出现分层、沉淀现象;同时为了延长活性肽口服液的保质期,对料液进行脱气处理,脱气压力为0.05 MPa,最后进行80 ℃灭菌30 min。
  1.3.8 活性肽口服液的感官评价
  参考王林山等[25]的感官分析评级指标,从色泽、香味、滋味、组织状态4 个方面对上述3 种公犊奶牛肉活性肽口服液进行综合评分,有差距的酌情扣分,10 分为满分。评分标准如表4所示。
  由图1可知,随着酶解时间的增加,各酶解产物的DPPH自由基清除率均呈现先升高后降低的趋势。其中,酸性蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率在反应5 h时达到最高,为86.24%;木瓜蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率在3 h时达到最高,为85.71%,4 h之后明显下降;动物蛋白水解复合酶酶解产物的DPPH自由基清除率在3 h时达到最高,为76.10%,随后在1 h内,迅速降低至40%左右;碱性蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率变化很小,且一直处在较低水平(40%以下),这是由于碱性蛋白酶是一种疏水性蛋白,不适合动物蛋白的水解,比较适合植物蛋白水解;而中性蛋白酶酶解产物的DPPH自由基清除率在反应初期就迅速增加,在3 h时就达到最高(90.17%),并且中性蛋白酶是一种内切酶,可用于各种蛋白质,将各种大分子蛋白质水解成小分子肽或氨基酸,有利于蛋白质的有效吸收和利用。例如,陈卫明[26]采用酶解法,筛选出中性蛋白酶为制备贻贝抗氧化肽的最适蛋白酶。
  酶的选择是本研究的关键,酶的种类决定了肽链长度和水解的作用位点。同时,酶的选择决定了基团特异性和不同酶解产物,决定产物的功能和性质。对比酶解不同物質的最适蛋白酶发现,碱性蛋白酶更适合水解植物蛋白,而中性蛋白酶更适合水解动物蛋白,综合考虑反应时间及DPPH自由基清除率,并且中性蛋白酶又是一种微生物蛋白,相对其他酶的成本更低,因此选择中性蛋白酶作为酶法制备初生公犊奶牛肉抗氧化肽的蛋白酶,并在此基础上优化反应条件。
  2.2 中性蛋白酶酶解初生公犊奶牛肉的单因素试验结果
  2.2.1 pH值对DPPH自由基清除率的影响
  小写字母不同,表示差异显著(P<0.05)。图3~5同。
  由图2可知,在pH值为7.0时,酶解产物的DPPH自由基清除率达到最大(83.2%),与其他pH值条件下酶解产物的DPPH自由基清除率相比具有显著性差异(P<0.05)。在酶水解过程中,pH值是决定酶活性的重要因素之一。pH值偏酸或偏碱均会降低酶的活性,影响蛋白酶和底物的结合,使底物蛋白的水解程度下降,从而影响抗氧化活性肽的产生[27]。因此,确定最适pH值为7.0。
  2.2.2 酶解温度对DPPH自由基清除率的影响
  由图3可知,酶解产物DPPH自由基清除率随着酶解温度的升高而逐渐增大,在55 ℃达到最大值85.6%(P<0.05),然后随酶解温度的进一步升高而降低。低温条件下,酶结构稳定,当酶解温度从40 ℃增加到55 ℃,蛋白水解反应占据主导地位;随着酶解温度的升高,酶的活性不断增强,水解反应程度增大,抗氧化活性增强[28]。高温会破坏酶的结构,使其失活,当酶解温度超过60 ℃时,酶活性下降,水解速率下降,生成的抗氧化肽段减少,因此酶解物的DPPH自由基清除率下降。刘进杰等[29]的研究结果表明,中性蛋白酶的最佳酶解温度为55 ℃,此温度条件下螺旋藻酶解物的抗氧化性最高,与本研究的结果一致。因此,确定中性蛋白酶的最佳酶解温度为55 ℃。
  2.2.3 加酶量对DPPH自由基清除率的影响
  由图4可知:加酶量为0.3~0.6 g/100 mL时,酶解产物的DPPH自由基清除率呈现上升趋势(P<0.05);当加酶量从0.6 g/100 mL增加到1.2 g/100 mL时,DPPH自由基清除率基本无变化(P>0.05);当加酶量超过0.6 g/100 mL后,DPPH自由基清除率显著下降(P<0.05)。随着加酶量的增加,酶解产物的抗氧化活性逐渐增加,但当酶添加量达到一定水平时,酶解产物的抗氧化活性降低。这主要是由于加酶量增加,酶解能力增强,体系初始反应速率很快,大多数蛋白质在短时间内降解成肽[30];当蛋白质浓度降低到一定水平时,蛋白质水解速率减缓,DPPH自由基清除率的增加变得缓慢。酶质量浓度过大时,当蛋白质水解成多肽后,这些具有抗氧化性的多肽继续被降解为无抗氧化性的小肽段及游离氨基酸,造成酶解物DPPH自由基清除率降低。为了节约酶用量、降低成本,确定水解初生公犊奶牛肉蛋白质的酶用量为0.6 g/100 mL。   2.2.4 酶解时间对DPPH自由基清除率的影响
  由图5可知,酶解产物的DPPH自由基清除率随酶解时间的增加而显著上升(P<0.05);酶解时间3~4 h时,DPPH自由基清除率无明显变化(P>0.05);酶解时间超过4 h后,酶解产物的DPPH自由基清除率明显下降(P<0.05)。这是由于随着酶解时间的延长,抗氧化肽可能会过度水解,短肽和氨基酸含量增加[31],从而使酶解物的DPPH自由基清除率下降。为了节约成本,确定酶解初生公犊奶牛肉蛋白质的时间为3 h。
  2.3 响应面分析法优化初生公犊奶牛肉酶解条件
  根据单因素试验结果,选择pH值、酶解温度、加酶量和酶解时间4 个因素,以DPPH自由基清除率为响应值,设计4因素3水平的响应面试验。中性蛋白酶水解公犊奶牛肉的条件优化采用Box-Behnken试验设计进行29 组试验,其中1~24组为分析试验和零点试验,25~29组为中心点重复试验。试验方案如表5所示,显著性检验和方差分析如表6所示。
  对表5的实验数据进行处理,得到公犊奶牛肉酶解物DPPH自由基清除率(Y)对pH值(A)、酶解温度(B)、加酶量(C)及酶解时间(D)的二次多项式回归方程:Y=89.83-4.55A-2.73B-0.62C-1.32D+11.25AB-1.73AC+3.50AD-3.00BC-9.58BD-0.48CD-8.30A2-19.95B2-10.19C2-7.08D2。
  由表6可知,模型中的失拟项P=0.11>0.05(不显著),表明该设计模型拟合程度较好。模型的F=4.99,P=0.002<0.01,表明该模型极显著[32]。综合以上分析结果,说明模型方程可以较好地反映其真实性[33],可用于研究所选4 个因素的变化对公犊奶牛肉酶解液DPPH自由基清除率的影响,得到最佳工艺条件。4 个因素对酶解产物DPPH自由基清除率大小的影响顺序为pH值>酶解温度>酶解时间>加酶量。因素A以及AB、BC、BD、CD的两两因素交互作用对酶解产物DPPH自由基清除率的影响显著(P<0.05)。
  由图6~11可知,各因素之间两两交互作用的响应面图呈抛物线形状。其中AB、BD、BC、CD的两因素交互作用响应面坡度较为陡峭,其椭圆形的等高线表明两因素具有显著的交互作用[28]。AC、AD的响应曲面较为平缓,其圆形的等高线表明两因素交互作用不显著。响应曲面及等高线图结果与回归模型方差分析的结果基本一致。利用Design Expert 8.05b软件得出最优酶解条件为pH值6.80、酶解温度54.17 ℃、加酶量0.61 g/100 mL、酶解时间2.92 h。
  2.4 验证实验考虑实际操作过程中的实施情况,可修正酶解参数为pH值6.80、酶解温度54 ℃、加酶量0.61 g/100 mL、酶解时间2.92 h。在此条件下进行3 次平行实验,测得DPPH自由基清除率为(92.25±0.51)%,与预测值91.03%相比误差为1.22%,表明预测值和实际值有很好的拟合性,说明模型优化出的条件较为准确,证明中性蛋白酶水解制备初生公犊奶牛肉酶解产物时最佳水解条件的可靠性和预测结果的实际可行性。
  2.5 酶解产物的SDS-PAGE分析M为标准蛋白(Marker);1~9分別为水解0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h的酶解产物。
  由图12可知:上清液中的蛋白质都是大分子蛋白质,其分子质量基本上都大于75 kDa;加入蛋白酶后,随着水解反应的进行,大分子蛋白质被水解完全,不再出现清晰的条带;酶解产物电泳图的条带主要集中在11 kDa以下的位置,并且随着反应的进行,条带颜色越来越深。通过蛋白质分子的电泳迁移率计算多肽的分子质量,可以判断出随着酶解反应的进行,牛肉大分子蛋白质被水解成分子质量小于7 kDa的肽段或游离氨基酸。
  2.6 初生公犊奶牛肉活性肽口服液的制备
  本实验室的前期工作已对初生公犊奶牛肉酶解产物中的氨基酸进行了检测,酶解产物中含有大量的游离氨基酸,其中8 种必需氨基酸占酶解产物总游离氨基酸的51.65%[4]。此外,还在酶解产物中检测到0.176 mg/mL的牛磺酸[34]。研究表明,牛磺酸具有调节心肌细胞膜功能、抗氧化、解毒和维持细胞内外渗透压等作用[35]。
  以公犊奶牛肉酶解产物调配的功能性口服液,按照其色泽、香味、滋味和组织状态为考核指标,召集30 名评价员,采用盲标的形式按照感官评分标准对3 种口服液进行打分,并比较不同因素及水平产品的质量状况。
  由表7可知,得分最高的为配方3,加入蜂蜜使口服液的滋味及组织状态最好。通过感观评价得出口服液的最适配方为蜂蜜60 g/L、食盐0.6 g/L、氯化钾0.1 g/L,调配出来的口服液为色泽均匀一致、呈棕黄色的透明液体,味甘甜,具有牛肉风味,无外来不良气味,无异物和沉淀物。
  3 结 论
  选择中性蛋白酶作为酶法制备初生公犊奶牛肉抗氧化肽的最适蛋白酶,并对水解产物的DPPH自由基清除率进行测定和分析,并通过响应面优化分析方法对酶解条件进行优化,得到最适的反应条件,即pH值6.80、加酶量0.61 g/100 mL、酶解温度54 ℃、酶解时间2.92 h。通过初生公犊奶牛肉水解产物的SDS-PAGE分析,进一步验证了在中性蛋白酶作用下初生公犊奶牛肉水解为分子质量小于7 kDa的多肽。最终,利用酶解得到的产物制备了一种具有抗氧化活性的多肽口服液,并通过感观评价优化了口感,使其更受大众的欢迎。
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