硒化多糖对黑鲷存活、免疫力和抗氧化性能的影响

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　　关键词：黑鲷;硒化多糖;存活率;免疫力;抗氧化性能
　　硒（Se）已被证明是动物必需的微量元素，在机体的生长、免疫和抗氧化等方面具有重要作用[1-2]。硒在硬骨鱼类的新陈代谢中发挥着重要作用，关于硬骨鱼类的硒需求量已开展了大量研究[3-4]。膳食硒不足可导致鱼类摄食率降低、生长缓慢、免疫力降低等，而膳食硒过量会导致饲料效率降低、抑制生长和生物毒性等[5-7]，因此，适量的膳食硒对鱼类的生长至关重要。自然界中的硒分为有机硒和无机硒2种形式，与无机硒相比，有机硒具有较高的抗氧化性、硒保留率、消化率和生物可利用度，而且具有较低的毒性[8-10]。硒化多糖是一种新型的有机硒，具有较强的抗氧化性能[11-12]。研究表明，多糖经过硒化修饰可增强其抗氧化和抗凝血活性[13]。然而，目前关于硒化多糖作为水产养殖动物膳食硒源，对水产动物免疫力和抗氧化性能影响的研究较少。
　　黑鲷（Acanthopagrus schlegelii），具有广温、广盐性、抗逆性强、生长迅速、肉质好等优点，是人工养殖和沿海增殖放流的优良品种，市场前景广阔[14-15]。黑鲷的养殖模式主要以海水网箱养殖和海水池塘养殖2种为主，随着黑鲷养殖规模不断扩大、集约化程度不断提高及海水污染日益严重，黑鲷养殖细菌性、寄生虫性、病毒性病害频发[16]，给养殖生产造成了极大的经济损失，而鉴于传统药物对食品安全和环境的危害，开发高效的新型安全免疫增强剂成为当务之急。攻毒试验是免疫增强剂效果最直观的反映方式。本试验研究了硒化多糖对攻毒试验后黑鲷存活率、免疫力和抗氧化性能的影响，为黑鲷饲料免疫增强剂的开发提供基础数据。
　　1 材料与方法
　　1.1 攻毒试验设计
　　试验用黑鲷幼鱼由浙江省海洋水产研究所试验场提供，养殖于浙江省海洋水产研究所西轩岛试验基地室内流水系统中。挑选体质健康、大小均匀、初始体质量为（13.00±0.20） g的黑鲷幼鱼随机分为6组，每组3个重复，每个重复25尾，放入容积为310 L（水体260 L）的玻璃纤维缸内微流水式饲养8周。海水经沉淀、过滤后使用，流速控制在 2 L/min，平均水温为（27±1） ℃，盐度26～29 g/L，溶解氧>5.0 mg/L。养殖试验期间，试验黑鲷分别投喂6组饲料（D1～D6），每天投喂2次，投喂时间分别为08：00和16：00，每次投喂至眼观饱食状态。
　　黑鲷经过8周的饲养试验，每缸随机选取10尾，腹腔注射培养24 h的副溶血弧菌液0.2 mL/尾，菌液浓度为5.5×108 CFU/mL，开展为期10 d的攻毒试验，攻毒期间正常饲养。每日记录各试验组黑鲷死亡率。
　　1.2 饲料配方
　　基于笔者所在研究团队前期黑鲷饲料营养需求研究结果，配制6组等氮等能饲料（D1～D6）。D1～D6组试验饲料分别添加硒化多糖，使得试验饲料中外源有机硒的添加量为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、3.0 mg/kg。硒化多糖由笔者所在实验室自行制备，通过壳寡糖与亚硒酸钠螯合而成，分子量为50 ku，硒含量的实测值为 17.7 mg/g。饲料原料粉碎过80目筛，充分均匀混合后，制成直径为2.5 mm的硬颗粒饲料，采用空调抽湿、风扇干燥72 h，分装标记后置于-20 ℃冰柜中保存备用。测定试验饲料D1～D6中硒的含量分别为0.34、0.52、0.68、091、1.08、3.06 mg/kg。各组试验饲料配方组成及营养成分值见表1。
　　1.3 样品采集及分析测定
　　养殖试验结束后，将试验鱼饥饿24 h后，采用MS-222（60 mg/L）麻醉，记录每缸试验鱼数目，测量体长、体质量。所有试验鱼尾静脉取血，置于离心管中，4 ℃静置2 h，3 000 r/min 离心15 min，取上层血清，立即用液氮快速冷冻，然后保存于-80 ℃冰箱中，待分析用。
　　血清中溶菌酶（LZM）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活力和MDA含量，采用南京建成生物工程研究所试剂盒检测。
　　1.4 数据处理
　　本试验结果数据均采用“平均数±标准差”（x±s）表示，用SPSS 16.0软件对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）后采用Tukeys多重比较检验，显著水平P<0.05。
　　2 结果与分析
　　2.1 硒化多糖对攻毒试验后黑鲷血清免疫力的影响
　　由图1可知，在给黑鲷注射副溶血弧菌10 d后，随着饲料中硒含量的增加，黑鲷血清溶菌酶（LZM）活性呈现升高的趋势，饲料中硒含量为 3.06 mg/kg 的试验组黑鲷血清LZM活性最高，显著高于除饲料硒含量为0.91、1.08 mg/kg之外的其他各试验组（P<0.05）。
　　2.2 硒化多糖对攻毒试验后黑鲷血清抗氧化性能的影响
　　由图2、图3和图4可知，在给黑鲷注射副溶血弧菌10 d后，随着饲料中硒含量的增加，黑鲷血清超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性均呈现升高趋势，且均在饲料中硒含量为3.06 mg/kg的试验组达到最大值，显著高于饲料中硒含量为0.34、0.52和 0.68 mg/kg 的试验组（P<0.05），但与饲料中硒含量为0.91、1.08 mg/kg的试验组没有显著差异（P>0.05）。
　　由圖5可知，在给黑鲷注射副溶血弧菌10 d后，随着饲料中硒含量的增加，黑鲷血清丙二醛（MDA）含量呈现降低的趋势，在饲料中硒含量为3.06 mg/kg的试验组达到最小值，显著低于除饲料中硒含量为0.91、1.08 mg/kg之外的各试验组（P<0.05）。
　　2.3 饲料中添加硒化多糖对攻毒试验后黑鲷累积死亡率的影响 　　由图6可知，在给黑鲷注射副溶血弧菌10 d后，黑鲷的累积死亡率随着饲料中硒含量的增加呈现降低的趋势，饲料中硒含量为1.08、3.06 mg/kg的试验组黑鲷的累积死亡率最低，显著低于除饲料中硒含量为0.91 mg/kg之外的各试验组（P<005）。
　　3 讨论与结论
　　3.1 饲料中添加硒化多糖对攻毒试验后黑鲷免疫力的影响
　　鱼类是特异性免疫和非特异性免疫并存的脊椎动物，但与哺乳动物相比，鱼类特异性免疫机制还不完善，在抵御病原微生物时主要依赖非特异性免疫发挥作用[17]。溶菌酶通过引发溶菌反应和作为调理素发挥其抗菌活性[18-19]，是反映动物非特异免疫功能的重要生理指标。许多研究表明，免疫增强剂可以提高鱼类血清溶菌酶的活力，例如陈兴发研究发现，姜黄素可以提高罗非鱼的血清LZM活力[20]。宋晓玲等将0.1%和1.0% 2种浓度的肽聚糖悬液注射入牙鲆体内，测定发现牙鲆血清溶菌酶活性显著提高[21]。郭玉娟等研究发现，在饲料中添加250～450 mg/kg的肽聚糖可显著提高彭泽鲫的血清溶菌酶活力[22]。硒能增强动物的体液和细胞免疫功能[23]，Low等将丝鳍毛足鲈暴露于含硒 05 g/m3 的水体2周后，发现丝鳍毛足鲈血浆溶菌酶活力升高33.72%[24]。本研究发现，饲料中添加硒化多糖可以显著提高副溶血弧菌感染黑鲷的血清LZM活力，当饲料硒含量低于0.91 mg/kg时，黑鲷的血清LZM活力随着饲料硒含量的增加显著升高（P<0.05），当饲料硒含量高于0.91 mg/kg时，黑鲷的血清LZM活力不再显著升高（P>0.05）。这可能是因为饲料硒不足时，补充膳食硒能夠提高黑鲷血清LZM活力，而膳食硒满足黑鲷需求后，继续补充膳食硒对黑鲷血清LZM活力没有显著影响。研究结果表明，硒化多糖能够提高副溶血弧菌感染后黑鲷的免疫力，以增强其对副溶血弧菌感染的抵抗力。以免疫力为评价指标，黑鲷对饲料中硒的最适需求量为0.91 mg/kg。
　　3.2 饲料中添加硒化多糖对攻毒试验后黑鲷抗氧化性能的影响
　　血清中SOD、CAT和GPx活性以及MDA含量是反映血清抗氧化能力的重要指标[25-27]。SOD可以催化超氧阴离子形成H2O2和O2[28]，随后H2O2在GPx和CAT的作用下分解生成水和氧气[29-30]。GPx、SOD和CAT被认为是细胞防御功能的第1道防线，GPx和SOD活性以及两者之间的平衡对于抵抗氧化损伤具有重要的保护作用[31]。硒是GPx的重要组成部分[32]，GPx的活性与机体硒含量密切相关，在异育银鲫[33]、鲤鱼[34]，饲料中添加硒能显著增加鱼体GPx活力，且GPx活力与硒添加量呈正相关关系。MDA是脂质过氧化的产物，通常被作为检测氧化损伤的重要指标[35]。Burhan等研究发现，适量添加亚硒酸钠能使虹鳟血清MDA含量降低[36]。本研究中，随着饲料中硒化多糖添加量的增加，当饲料硒含量低于0.91 mg/kg时，黑鲷幼鱼血清SOD、CAT和GPx的活性与饲料硒含量呈现正相关（P<0.05），血清中MDA含量与饲料硒含量呈现负相关（P<0.05），而当饲料硒含量高于091 mg/kg时，黑鲷幼鱼血清SOD、CAT、GPx的活性及MDA含量不再显著变化（P>0.05），表明饲料中添加硒化多糖可以显著提高副溶血弧菌感染黑鲷的血清抗氧化性能，且血清抗氧化能力与硒的添加量呈现正相关。以抗氧化性能为评价指标，黑鲷对饲料中硒的最适需求量为0.91 mg/kg。
　　3.3 饲料中添加硒化多糖对攻毒试验后黑鲷累积死亡率的影响
　　攻毒试验是免疫增强剂效果最直观的反映方式。硒可以影响水生动物的疾病抵抗力，硒缺乏会降低动物的免疫功能，摄食缺硒饲料可使其疾病抵抗力降低，适当补充外源硒可以增强它们的免疫功能，从而增强其疾病抵抗力[37]。Wang等研究表明，斑点叉尾的抗病力与饲料硒水平密切相关，0.20 mg/kg 的硒代蛋氨酸和0.40 mg/kg的酵母硒可显著提高斑点叉尾经爱德华氏菌攻毒后的存活率[38]。华雪铭等报道，添加剂酵母硒的含量与嗜水气单胞菌对异育银鲫的LC50密切相关，随着添加剂酵母硒含量的升高，LC50升高，即异育银鲫对嗜水气单胞菌的抵抗力增强[39]。本研究中，在给黑鲷注射副溶血弧菌，经过10 d的攻毒试验后，饲料中添加硒化多糖可以显著降低黑鲷的累积死亡率，当饲料硒含量低于0.91 mg/kg时，黑鲷的累积死亡率随着饲料硒含量的增加显著降低（P<0.05），当饲料硒含量高于0.91 mg/kg时，黑鲷的累积死亡率不再显著降低（P>0.05）。研究表明，硒化多糖可以提高黑鲷对副溶血弧菌感染的抵抗能力，提高养殖存活率，这可能是硒化多糖通过提高副溶血弧菌感染黑鲷的血清免疫力和抗氧化性能实现的。以副溶血弧菌感染后黑鲷的存活率为评价指标，黑鲷对饲料中硒的最适需求量为0.91 mg/kg。
　　综上所述，饲料中添加硒化多糖可以提高副溶血弧菌感染黑鲷的免疫力和抗氧化性能，提升黑鲷对副溶血弧菌感染的抵抗能力，降低黑鲷感染副溶血弧菌后的死亡率，提升黑鲷养殖存活率。以副溶血弧菌感染后黑鲷的免疫力、抗氧化性能和存活率为评价指标，黑鲷对饲料中硒的最适需求量均为091 mg/kg。
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