川黄连对大鼠化学灼烧型口腔溃疡的抗炎作用观察

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　　摘要：目的  探究川黃连对大鼠化学灼烧型口腔溃疡的抗炎作用机理。方法  利用化学灼烧的方法，在30只SD大鼠的舌背部制造口腔溃疡模型，按照随机抽样分为实验组和对照组，每组15只。实验组使用川黄连粉末直接覆盖于溃疡表面，对照组不进行处理，造模后48 h、第3天，比较两组大鼠水肿面积变化率、口腔溃疡组织学分级，分别以肉眼和切片比较两组大鼠由于化学烧灼而导致的粘膜水肿恢复情况。结果  ①造模后48 h可见大鼠舌腹粘膜发生炎性水肿反应，水肿部位粘膜泛白，表面多个小水泡，凹凸不平，稍隆起，内含清亮液体，边缘清晰，也可由多个小水泡融合而形成的边缘不规则的较大水泡;造模后第3天，实验组粘膜水肿基本消退，个别水肿未完全消失但也基本局限与溃疡附近;对照组粘膜水肿也有消退，但水肿面积与实验组有所差别。②造模后48 h粘膜水肿形成面积达到最大值，随后逐渐缩小;造模后第3天，实验组水肿面积变化率为（0.873±0.020）%，高于对照组的（0.714±0.064）%，差异有统计学意义（P<0.05）。③实验组口腔溃疡组织学分级中Ⅰ、Ⅱ及大鼠少于对照组，Ⅲ、Ⅳ级多于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;HE染色显示，实验组炎细胞浸润程度较低，细胞形态多完整，组织水肿程度低，坏死组织少，部分切片可见肉芽组织充填于溃疡创面;对照组炎细胞浸润程度高，可见部分炎细胞破裂死亡，坏死组织少，鲜见肉芽组织长入溃疡创面。结论  川黄连对化学灼烧型口腔溃疡引起的炎症性水肿有促进消退的作用，同时可以降低溃疡组织内炎细胞的浸润。对化学刺激性溃疡有抗感染，抗炎症的作用。
　　关键词：口腔溃疡;黄连;化学灼烧;大鼠
　　中图分类号：R781.5                               文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.019
　　文章编号：1006-1959（2020）11-0061-03
　　Abstract：Objective  To explore the anti-inflammatory mechanism of Chuanhuanglian on chemically burned oral ulcer in rats.Methods  Using chemical burning method， an oral ulcer model was created on the back of the tongue of 30 SD rats， which were divided into an experimental group and a control group according to random sampling， with 15 rats in each group. The experimental group used Chuanhuanglian powder to directly cover the surface of the ulcer， and the control group did not process it. At 48 h and 3 d after the model， the rate of change in edema area and the histological grade of oral ulcer were compared between the two groups. Recovery of mucosal edema caused by chemical burning in two groups of rats. Results  ①At 48 h after modeling， an inflammatory edema reaction occurred in the mucous membrane of the tongue and abdomen of the rat. The mucosa of the edema site was whitened， with multiple small blisters on the surface， uneven， slightly raised， containing clear liquid， clear edges， and can also be fused by multiple small blisters the large blisters with irregular edges formed; on the third day after modeling，the mucosal edema in the experimental group basically subsided， and some individual edema did not completely disappear but was basically limited to the vicinity of the ulcer; the mucosal edema in the control group also subsided， but the edema area was different from the experimental group. ②The area of formation of mucosal edema reached the maximum at 48 h after modeling， and then gradually reduced; on the third day after modeling， the rate of change of edema area in the experimental group was （0.873±0.020）%， higher than that of the control group （0.714±0.064）% ，the difference was statistically significant （P<0.05）. ③The histological grade of oral ulcers in the experimental group was less than that of the control group Ⅰ， Ⅱ and rats， and the grades Ⅲ and Ⅳ were more than the control group， the difference was statistically significant （P<0.05）; HE staining showed that the degree of inflammatory cell infiltration in the experimental group was low， more complete cell morphology， low degree of tissue edema， less necrotic tissue， granulation tissue filled in ulcer wounds in some sections; high degree of infiltration of inflammatory cells in the control group， partial inflammatory cell rupture and death， few necrotic tissues， rarely seen granulation tissue growth into the ulcer wound.Conclusion  Chuanhuanglian can promote the resolution of inflammatory edema caused by chemical burn oral ulcer， and can reduce the infiltration of inflammatory cells in ulcer tissue. It has anti-infection and anti-inflammatory effects on chemically stimulated ulcers. 　　Key words：Oral ulcer;Coptis rhizoma;Chemical burn;Rat
　　口腔溃疡（canker ulcer）又称为阿弗他溃疡，是口腔科最常见的一种黏膜疾病，患者常有明显的疼痛感，严重时可影响其生活质量，目前尚缺乏有效的根治方法。一般可通过局部涂抹外用药物，改善疼痛状态，促进愈合的方式进行治疗。黄连（coptidis rhizoma）含有小檗碱、黄连碱、表小檗碱、甲基黄连碱、巴马汀、小柴红碱及药根碱等多种生物碱[1];具有消炎抗菌，促进溃疡愈合等多种功效[2]。本实验拟通过建立SD大鼠口腔溃疡模型研究川黄连是否具有抗炎及促进溃疡愈合的作用，并探讨其作用机制，旨在为临床应用黄连治疗口腔溃疡提供实验依据，报道如下。
　　1材料与方法
　　1.1实验动物  选取6～8周龄SD雄鼠，体重300 g左右，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，生产许可证SCXK（湘）2019-0004，饲养环境温度为22～25℃，相对湿度40%～70%，12 h光照循环;动物自由饮水、进食。
　　1.2实验药品  川黄连（购于四川省洪雅县瓦屋山黄连种植基地，为当地野生黄连取根茎部位进过消毒后直接研磨）、75%酒精（湖南科伦）、冰醋酸（天津市风帆化学）、2500 ml苏木素-伊红染色液（Wexis）、100 g中性树胶（中国上海标本模型厂）、塑AR2500 ml无水乙醇（湖南汇虹）、AR500 ml二甲苯（湖南汇虹）。
　　1.3实验器材  10 cm解剖剪（上海金钟）、10 cm解剖镊（上海金钟）、4号半针、1 ml一次性注射器（湘江）、10 cm玻璃滴管（华鸥）、JK-6生物组织摊烤片机（武汉俊杰电子有限公司）、DM2000 LED显微镜（莱卡）、62022100盖玻片（Wexis）、188105载玻片（亿洲）。
　　1.4方法
　　1.4.1模型构建  30只SD大鼠实验室适应性喂养1周，使用生理盐水配制60%冰醋酸，避光室温保存备用。按照每100 g体重腹腔注射0.4 ml的10%水合氯醛剂量麻醉大鼠，造模部位选取大鼠舌腹进行造模，先行生理盐水清洗2～3次，吹干后采用同一口径的玻璃平口胶头滴管吸取60%冰醋酸，将液面稍突出胶头滴管口，使其平稳放置在大鼠腹部粘膜处，确定口腔溃疡的形成面与胶头滴管口一致，放置烧灼60 s，取开后立即用大量生理盐水冲洗。实验组大鼠处理：在烧灼部位涂抹经过研磨的黄连粉末60 s后用生理盐水冲洗，连续使用3 d。造模后第3天依照上述方法麻醉大鼠，观察各组大鼠口腔溃疡形成情况，拍照记录。对两组大鼠实行安乐死，拍照后取舌放入福尔马林固定。
　　1.4.2切片染色  取大鼠烧灼部位组织进行切片染色，脱蜡：70 ℃烤片30 min，二甲苯（Ⅰ）中脱蜡10 min;二甲苯（Ⅱ）中脱蜡10 min，100%乙醇（Ⅰ）中5 min洗去二甲苯，100%乙醇（Ⅱ）中5 min洗去二甲苯。水化：95%乙醇中水化5 min，85%乙醇中水化5 min，75%乙醇中水化5 min，蒸馏水中水化待用。染色：苏木素染色3 min，流水冲洗2 min，1%盐酸酒精分化2 s，流水冲洗切片15 min，蒸馏水过洗1～2 s，伊红染色30 s。分化：根据颜色深浅用80%的乙醇分化，85%乙醇脱水5 min，95%乙醇脱水5 min，无水乙醇脱水10 min，无水乙醇继续脱水10 min。透明：二甲苯（Ⅰ）透明10 min;二甲苯（Ⅱ）再次透明10 min。封片：在石蠟切片的中央滴加一滴中性树胶，盖上盖玻片封固。镜检：显微镜下观察拍照。
　　1.5观察指标  比较两组大鼠水肿面积变化率、烧灼部位组织学分级，分别以肉眼和切片比较两组大鼠由于化学烧灼而导致的粘膜水肿恢复情况。水肿面积变化率：根据溃疡面积变化率=（初始溃疡面积-现溃疡面积）/初始溃疡面积×100%[3]可以推得水肿面积变化率=（初始水肿面积-现水肿面积）/初始水肿面积×100%。按照公式可以推出：水肿面积变化率=（1-现水肿面积所占舌腹面积比例/初始水肿面积所占舌腹面积比例）。水肿面积所占舌腹面积比例的测量方法按照填补法进行，将刻有宽度为3 mm网格线的透明玻璃板轻压至大鼠舌腹部（注意保护舌系带），数出水肿面积所占格数占舌腹总面积格数即可较为准确的故算出水肿面积占舌腹总面积的百分比。组织学分级：在光学显微镜下观察大鼠舌腹部口腔黏膜结构，口腔溃疡组织学分级标准参考文献[4]进行，正常为0 分，Ⅰ级为1～3分，Ⅱ级为4～6分，Ⅲ级为7～9分，Ⅳ级为10～12 分，见表1。
　　1.6统计学方法  采用SPSS 19.0软件处理数据，计量资料采用（x±s）表示，比较行双样本t检验;计数资料采用（n）表示，比较行非参数检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
　　2结果
　　2.1两组大鼠舌腹部水肿情况  造模48 h后可见冰醋酸对大鼠舌腹粘膜的刺激，舌腹粘膜发生炎性水肿反应，水肿部位表现为粘膜泛白，由多个小水泡起所组成的表面凹凸不平的不规则形态，稍隆起，内含清亮液体，边缘与正常粘膜组织分界较清晰，也可由多个小水泡融合而形成的边缘不规则的较大水泡。个体之间存在差异但均属于炎性水肿的病理范畴。用药3 d后，实验组大鼠粘膜水肿基本消退，个别水肿未完全消失但也基本局限与溃疡附近。对照组粘膜水肿也有消退，但水肿面积依然与实验组有一定差距，见图1。
　　2.2两组大鼠舌腹水肿面积变化趋势比较  建模48 h后，两组粘膜水肿形成面积达到最大值，随后逐渐缩小。用药3 d后，实验组黏膜水肿基本完全消退，对照组尚未完全消退。实验组水肿变化率为（0.873±0.020）%，高于对照组的（0.714±0.064）%，差异有统计学意义（P<0.05）。 　　2.3两组口腔溃疡组织学分级及HE染色比较  实验组口腔溃疡组织学分级中Ⅰ、Ⅱ及大鼠少于对照组，Ⅲ、Ⅳ级多于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2;HE染色显示，实验组炎细胞浸润程度较低，细胞形态多完整，组织水肿程度低，坏死组织少，部分切片可见肉芽组织充填于溃疡创面;对照组炎细胞浸润程度高，可见部分炎细胞破裂死亡，坏死组织少，鲜见肉芽组织长入溃疡创面，见图2。
　　3讨论
　　口腔溃疡又称为阿弗他溃疡，是口腔科最常见的一种黏膜疾病，患者常有明显的疼痛感，严重时可影响患者的生活质量，目前尚缺乏有效的根治方法。临床用药的主要目的是减轻创面疼痛，促进粘膜愈合，改善患者生活质量。口腔溃疡的成因尚不明确，与溃疡形成有关的因素可分为：机械刺激、物理因素、化学因素、生物因素、免疫因素、心理因素等多种因素单独作用或共同作用。本文中口腔溃疡模型的建立主要运用化学烧灼方式形成，由于冰醋酸对粘膜的刺激作用，粘膜出现了较为严重的炎症水肿反应。应用川黄连进行抗炎消毒抗菌治疗，从而达到减少炎症反应，减少炎细胞浸润，消除炎性水肿，抵抗外来或口腔内菌群对溃疡面的感染作用，从而促进创面的修复，缩短溃疡愈合时间。本次实验结果显示，实验组水肿消退速度快于对照组，创面的愈合情况优于对照组;且炎细胞浸润较少，坏死组织少，肉芽组织发育情况良好，创面恢复情况好。证明使用川黄连粉磨覆盖溃疡及水肿创面，可加快炎性水肿的消退，减少炎细胞的浸润，减轻炎症反应。同时由于川黄连的抗菌作用，保护了创面免受口腔内菌群的影响，减少继发感染，促进创面愈合。
　　中医理论认为黄连具有燥湿清热、泻火解毒的功能。现代药理学认为黄连具有抗菌，抗病毒，消炎的作用[2]。黄连中含有的生物碱如小檗碱等为广谱的抗菌药物，对金黄色葡萄球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌等革兰阳性菌和大肠杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、结核杆菌、肺炎克雷伯氏菌、淋球菌等革兰阴性菌，以及红色毛藓菌、白色念珠菌等真菌敏感[5]。将黄连粉末直接覆于因化学灼烧而形成的创口之上，有保护创面，防止继发感染的作用。动物试验显示，黄连具有多种抑制炎症反应的成分，如小檗碱能够有效抑制急慢性炎症反应[6]，促进水肿的消除，结合本次结果可知，将黄连粉末直接覆于因化学灼烧刺激形成的水肿表面上，可以有效的促进炎性水肿的消退，可以抑制炎细胞的浸润，减轻炎症反应。
　　综上所述，川黄连对化学灼烧型口腔溃疡引起的炎症性水肿有促进消退的作用，同時可以降低溃疡组织内炎细胞的浸润，对化学刺激性溃疡有抗感染、抗炎症的作用。
　　参考文献：
　　[1]徐锦堂，王立群，徐蓓.黄连研究进展[J].中国医学科学院学报，2004，26（6）：704-707.
　　[2]杨念云，张启春，朱华旭，等.黄连的化学成分及药理作用研究进展[J].中草药，2018，49（20）：4919-4927.
　　[3]马聪聪，郑赛巍，彭健，等.生物活性玻璃促进大鼠口腔溃疡愈合疗效观察[J].同济大学学报，2019，40（3）：289-291.
　　[4]唐志立，彭贤东，王娅俐，等.知黄溃疡合剂对口腔溃疡模型大鼠的药效学研究[J].中国医药，2019，28（7）：6-8.
　　[5]余园媛，王伯初，彭亮，等.黄连的药理研究进展[J].重庆大学学报：自然科学版，2006，29（2）：107-111.
　　[6]Park SM，Min BG，Jung JY，et al.Combination of Pelargoniumsidoides and Coptischinensis root inhibitsnuclear factor kappa B-mediated inflammatory responsein vitro and in vivo [J].BMC ComplAlternat Med，2018，18（1）：20-32.
　　收稿日期：2020-03-02;修回日期：2020-03-30
　　编辑/成森
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