秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织分化的影响

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　　摘要 [目的]探讨秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织分化的影响。[方法]利用组织培养技术，研究秋水仙碱的不同浓度和处理时间对愈伤组织分化率和不定芽数量的影响。[结果]秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织不定芽分化率有很大的影响。阔叶猕猴桃愈伤组织在秋水仙碱0.05%下处理24 h，其不定芽分化率达100%，而对照为58.33%。在0.50%秋水仙碱浓度下处理24 h，海沃德愈伤组织的不定芽分化率达到最高为75%。金桃胚乳愈伤组织不定芽分化率达到最大时的秋水仙碱浓度为0.20%，处理时间为24 h。[结论]秋水仙碱处理对猕猴桃再生芽数的影响因猕猴桃种类而异，海沃德再生芽数的最佳组合：0.20%的秋水仙碱处理24 h;阔叶猕猴桃再生芽数的最佳组合：0.05% 的秋水仙碱处理24 h。
　　关键词 猕猴桃;愈伤组织;秋水仙碱;诱导;不定芽
　　中图分类号 S 663.4 文献标识码 A
　　文章编号 0517-6611（2020）16-0049-03
　　doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.16.013
　　Effect of Colchicine on Tissue Differentiation of Kiwifruit
　　LONG  Zi-li1，ZHANG Hui-qin2，LIU  Yong-li1 （1.College of Agriculture & Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou，Zhejiang 310058;2.Institute of Horticulture，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310021）
　　Abstract [Objective] To investigate the effect of colchicine on the differentiations of callus of kiwifruit.[Method]The effects of different concentrations and treatment times of colchicine on callus differentiation rate and number of adventitious buds were studied.[Result]Colchicine had a great effect on the rate of adventitious bud differentiation in kiwifruit.The rate of adventitious bud differentiation of Actinidia latifolia was 100% by 0.05% colchicine treatment for 24 hours，while the control was 58.33%;treated with 0.50% colchicine for 24 hours，the rate of adventitious bud differentiation of Hayward callus reached 75%.The differentiation rate of Jintao adventitious buds reached the maximum by 0.20% colchicines treatment for 24 hours.[Conclusion]The effect of colchicine treatment on the regeneration bud number of kiwifruit varied with kiwifruit species.The best combination of Hayward regeneration bud number was colchicine concentration of 0.20% for 24 h;the best combination of Actinidia latifolia regeneration bud number was 0.05% colchicine for 24 h.
　　Key words Kiwifruit;Callus;Colchicine;Induction;Adventitious bud
　　基金项目 浙江省农业新品种选育重大科技专项“猕猴桃新品种选育”（2016C02052-7-2）;
　　玉环市科技局项目“猕猴桃抗病砧木培育及应用推广”。
　　作者简介 龙自立（1983—），男，广西桂林人，硕士研究生，研究方向：园艺植物分子育种。*通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事园艺植物生物技术研究。
　　收稿日期 2020-01-11
　　
　　在植物诱变育种中，利用秋水仙碱进行诱变育种是一种传统的手段，且在许多植物诱变育种中均有报道，如葡萄[1]、厚皮甜瓜[2]、大葱[3-4]、阔叶风铃草[5]、白萝卜[6]、甘草[7]以及油菜[8]等。近年来利用组织培养与秋水仙碱诱导相结合的方法，进行诱变育种日趋成熟，以达到改良作物品种的目的。在猕猴桃的倍性诱导方面，徐靓[9]以二倍体中华猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.）品種‘脐红’、山梨猕猴桃（Actinidia rufa Planch.）与毛花猕猴桃（Actinidia eriantha Benth.）杂交后代SM及‘红阳’（Actinidia chinensis Planch.）×毛花猕猴桃杂交后代HM为材料，利用秋水仙素对3个材料进行多倍体诱导试验。但利用胚乳进行猕猴桃诱变的研究目前尚未见报道。笔者以猕猴桃金桃品种（Actindia chinensis cv.‘Jintao’）、海沃德品种（Actinidia deliciasa cv.‘Hayward’）的胚乳以及阔叶猕猴桃（Actinidia latifolia）的组培苗为材料进行研究，以期明确秋水仙碱对不同猕猴桃品种再分化的影响规律并获得有价值的猕猴桃多倍体材料。 　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　以海沃德（Actinidia deliciasa cv.‘Hayward’（2n= 6x=174）猕猴桃和金桃品种（Actindia chinensis cv.‘Jintao’（2n=4x=116））的胚乳愈伤组织以及阔叶猕猴桃（Actinidia latifolia）的组织培养试管苗为材料，使用BBI公司生产的秋水仙碱进行试验。
　　1.2 试验方法
　　取海沃德和桃金猕猴桃品种的果实，洗净后用自来水冲洗30 min，用75%乙醇灭菌1 min后再用0.2%HgCl2消毒20 min，然后灭菌水冲洗3次。在超净工作台内，取二者胚乳接种在灭菌后的1/2MS+1 mg/L 2，4-D+3 mg/L BA培养基上进行愈伤组织诱导。阔叶猕猴桃材料选取组培苗叶柄切成约0.5 cm长后接种在上述培养基中进行愈伤组织诱导。
　　上述得到的愈伤组织在无菌的秋水仙素溶液中 （0.01%、0.05%、0.10%、0.20%、0.50%）分别处理24、48、72、96 h，以蒸馏水为对照。海沃德和金桃胚乳愈伤组织的再分化培养基：1/2MS+0.1 μmol/L NAA+ 5 μmol/L BA+20 g/L;阔叶猕猴桃叶柄愈伤组织的再分化培养基：1/2MS+0.5 mg/L NAA+3 mg/L BA。培养45 d时进行统计，并用DPS 7.05软件进行数据分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织不定芽分化率的影响
　　从表1可以看出，秋水仙碱处理后猕猴桃愈伤组织不定芽分化率的變化有很大的随机性，但也表现出一定的规律性。随着秋水仙碱处理浓度的增加和处理时间的加大，猕猴桃愈伤组织不定芽分化率呈明显下降趋势。这说明过高浓度的秋水仙碱处理对猕猴桃愈伤组织的再分化有一定的抑制作用。其中在高浓度和长时间处理的组合条件下（72 h、96 h;0.20%、0.50%），猕猴桃愈伤组织在接种培养基5 d后，组织开始出现失绿和水渍状，生长也受到严重影响;在接种培养基15 d左右，愈伤组织全部死亡或部分死亡。
　　在秋水仙碱适当浓度和一定时间的组合条件下，不同猕猴桃愈伤组织的分化率比对照有所提高（表1）。其中在0.05% 浓度下处理24 h，阔叶猕猴桃愈伤组织的不定芽分化率达100%，而对照为58.33%，二者有显著差异。在0.50%秋水仙碱浓度情况下处理24 h，海沃德胚乳愈伤组织的不定芽分化率为75%，而对照仅为25%。从金桃胚乳愈伤组织不定芽分化率看，在秋水仙碱浓度0.2%处理24 h下达到最高为75%，而对照仅为16.67%。由此可见，适当浓度的秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织不定芽分化率也有一定的促进作用。
　　2.2 秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织再生芽数的影响
　　从表2可以看出，秋水仙碱对不同猕猴桃愈伤组织分化的再生芽数有明显的影响。在浓度为0.20%的秋水仙碱处理24 h下，海沃德胚乳愈伤组织的平均再生芽数达最高为6.29个。对于金桃胚乳愈伤组织的平均再生芽数，秋水仙碱处理对其影响不显著（表2）。秋水仙碱处理对阔叶猕猴桃叶柄愈伤组织再生芽数有明显的影响，即在秋水仙碱浓度为0.05%，处理时间为24 h下，平均再生芽数为7.58个，达到最大值;而对照为3.71个。由此可知，秋水仙碱处理对猕猴桃再生芽数的影响因猕猴桃种类而异。
　　3 讨论
　　在植物组织培养中利用秋水仙碱进行多倍体诱导已经有过许多尝试，并被证明是一种较有效的手段[10-14]。该试验从秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织不定芽分化率的影响来看，适当浓度的秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织不定芽分化率有一定的促进作用，秋水仙碱在一定浓度和时间的组合处理下，愈伤组织不定芽分化率均有提高。这一现象也在白花除虫菊同源四倍体诱导的试验[15]也有报道。
　　用秋水仙碱处理植物组织，不仅可以避免产生嵌合体的干扰现象，获得同质的多倍体;而且能反复多次试验，提高诱变率。秋水仙碱具有很大的毒性，高浓度的秋水仙碱不仅能使猕猴桃愈伤组织在培养中受害而生长缓慢，明显抑制不定芽分化，还会造成猕猴桃愈伤组织在培养中褐化死亡。因此，控制秋水仙碱的处理浓度和使用时间非常重要。
　　4 结论
　　秋水仙碱对猕猴桃愈伤组织不定芽分化率有很大的影响，阔叶猕猴桃愈伤组织在秋水仙碱0.05%浓度下处理24 h，其不定芽分化率达100%，而对照为58.33%。在0.50%秋水仙碱浓度下处理24 h，海沃德胚乳愈伤组织的不定芽分化率达到最大，为75%。金桃胚乳愈伤组织不定芽分化率达到最大时的秋水仙碱浓度为0.2%，处理时间为24 h。
　　 秋水仙碱处理对猕猴桃再生芽数的影响因猕猴桃种类而异，海沃德再生芽数的最佳组合：0.20%的秋水仙碱处理24 h;阔叶猕猴桃再生芽数的最佳组合：0.05%的秋水仙碱处理24 h。
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