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HPV感染对宫颈免疫微环境的影响

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  [摘要] 目的 比較高危型和低危型人乳头瘤病毒(HPV)感染后宫颈局部细胞因子和阴道微生态指标变化情况,分析不同HPV感染对宫颈局部免疫微环境的影响。 方法 收集2017年3月~2018年7月在湖南医药学院第一附属医院门诊就诊的妇女宫颈和阴道分泌物标本,用PCR-反向点杂交法检测HPV,根据检测结果将155例标本分为高危型HPV组(55例)、低危型HPV组(40例)和未感染HPV的对照组(60例),用酶联免疫吸附试验测定宫颈细胞保存液中的γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)和IL-21含量,并按全国临床检验操作规程做真菌、阴道滴虫、线索细胞、清洁度和pH检查。 结果 与对照组和低危型HPV组比较,高危型HPV组的IFN-γ和IL-21含量均显著降低(P < 0.01),但IL-4含量显著升高(P < 0.01);与对照组比较,低危型HPV组的IFN-γ含量显著降低(P < 0.01),但IL-4和IL-21含量比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。经相关性分析,高危型HPV组、低危型HPV组和对照组的IL-21与IFN-γ含量均呈正相关(r = 0.74,P < 0.01;r = 0.70,P < 0.01;r = 0.66,P < 0.01),高危型和低危型HPV组的IL-4与IFN-γ含量均呈负相关(r = -0.33,P < 0.05;r = -0.44,P < 0.01);高危型HPV组的IL-21与IL-4含量呈负相关(r = -0.30,P < 0.05)。此外,三组间真菌、阴道滴虫、线索细胞、清洁度和pH等微生态指标的比较,差异均无统计学意义(P > 0.05)。 结论 高危型HPV比低危型HPV感染后更易引起宫颈局部IL-4和IFN-γ的表达异常,可能与具有免疫促进作用的IL-21低表达有关。因此,维持宫颈局部正常免疫微环境、恢复机体的免疫调节功能对机体清除HPV、阻断HPV的持续感染非常重要。
  [关键词] 人乳头瘤病毒;免疫;微环境;细胞因子
  [中图分类号] R373.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2019)05(a)-0163-04
  Effects of HPV infection on cervical immune microenviroment
  GUI Fang1 HUANG Juan1 YANG Daqing2 LIU Liyan1
  1.School of Laboratory Medicine, Hu′nan University of Medicine, Hu′nan Province, Huaihua 418000, China; 2.Department of Clinical Laboratory, the First Affiliated Hospital of Hunan University of Medicine, Hu′nan Province, Huaihua 418000, China
  [Abstract] Objective To compare the changes of cervical local cytokines and vaginal microecological indicators after the infection of high-risk and low-risk human papillomavirus (HPV), and to analyze the effects of different HPV infections on the cervical local immune microenvironment. Methods Collection in March 2017 to July 2018 in the First Affiliated Hospital of Hu′nan University of Medicine Outpatient Clinic women specimens of cervical and vaginal secretions was carried out, PCR - reverse dot hybridization method was used to detect HPV, according to the results, the 155 cases were divided into high risk type HPV group(55 cases), low-risk HPV group (40 cases) and control group (60 cases), who were not infected with HPV. Cervical cell preservation solution enzyme linked immunosorbent test was carried out in the gamma interferon (IFN-γ), interleukin 4 (IL-4) and IL-21 content, and according to the national clinical inspection procedures, the fungi, vaginal trichomoniasis, clue cell, cleanliness, and pH checks were carried out. Results Compared with the control group and low-risk HPV group, the content of IFN-γ and IL-21 in high-risk HPV group was significantly decreased (P < 0.01), but the content of IL-4 was significantly increased (P < 0.01). Compared with the control group, the IFN-γ content of low-risk HPV group was significantly reduced (P < 0.01), but the difference between IL-4 and IL-21 was not statistically significant (P > 0.05). After correlation analysis, IL-21 was positively correlated with IFN-γ content in high-risk HPV group, low-risk HPV group and control group (r = 0.74, P < 0.01), r = 0.70, P < 0.01; r = 0.66, P < 0.01), IL-4 and IFN-γ contents in the high-risk and low-risk HPV groups were negatively correlated (r = -0.33, P < 0.05; r = -0.44, P < 0.01); IL-21 was negatively correlated with IL-4 in the high-risk HPV group (r = -0.30, P < 0.05). In addition, there were no statistically significant differences among the three groups in microecological indicators such as fungi, vaginal trichomonas, clue cells, cleanliness and pH (P > 0.05). Conclusion High-risk HPV is more likely to cause abnormal expression of local IL-4 and IFN-γ in the cervix after HPV infection than low-risk HPV infection, which may be related to the low expression of IL-21 with immune-promoting effect. Therefore, it is very important to maintain the local normal immune microenvironment in the cervix and restore the immune regulatory function of the body to remove HPV and block the continuous infection of HPV.   [Key words] Human papillomavirus; Immune; Microenviroment; Cytokines
  高危型人乳头瘤病毒是引起宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)和宮颈癌的主要病因。人乳头瘤病毒(HPV)感染在有性活动的人群中较为常见,大多数女性感染HPV后可自发清除病毒,仅少数发生持续感染并发展为宫颈癌[1],感染的发生发展一方面取决于HPV的感染型别,另一方面与宫颈局部微环境的免疫功能密切相关[2-3]。宫颈局部免疫微环境与阴道微生态系统、黏膜免疫系统、免疫细胞及细胞因子水平和功能密切相关[4]。在免疫应答过程中,以γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)、IL-21为代表的细胞因子在细胞免疫、体液免疫和免疫调节中发挥着重要作用。据此,本研究通过观察高危型和低危型HPV感染者宫颈局部IFN-γ、IL-4、IL-21水平和阴道微生态指标变化,进而分析不同HPV感染对宫颈局部免疫功能的影响及其机制,对阻断HPV的持续感染和预防CIN具有重要意义。
  1 材料与方法
  1.1 一般资料
  选择2017年3月~2018年7月在湖南医药学院第一附属医院门诊就诊的女性作为研究对象。纳入标准:①1周内无阴道用药;②1周内未服用抗菌药物;③1周内无性生活。排除标准:①月经期、妊娠期和哺乳期;②其他原因引起的阴道出血。同时,在分组时排除HPV多重感染情况。共筛选出155名受试者,年龄23~65岁,平均(40.81±9.53)岁,根据HPV分型检测结果分为三组:未感染HPV的对照组60例,年龄23~63岁,平均(39.35±10.01)岁;高危型HPV组55例,年龄25~65岁,平均(41.25±8.85)岁;低危型HPV组40例,年龄25~62岁,平均(42.33±9.36)岁。三组人群的年龄比较,差异无统计学意义(P > 0.05),具有可比性。
  1.2 仪器与试剂
  ETC811型PCR仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司);YN-H16型分子杂交仪(深圳市亚能生物技术有限公司);MB-530型酶标仪(深圳市汇松科技发展有限公司);PCR-反向点杂交法HPV基因分型检测试剂盒(深圳市亚能生物技术有限公司,批号:QX201 817029);Human IL-4、IL-21、IFN-γ ELISA试剂盒(深圳市雨朵生物技术有限公司,批号:E20171201A)。
  1.3 标本采集
  标本由妇科医师采集,用盐水湿润的棉拭子在阴道上1/3处旋转一圈,要求棉拭子与阴道的接触时间不少于25 s,将棉拭子取出放入无菌试管中。另取一支棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去,再将一次性无菌宫颈采样器伸入宫颈内顺时针方向旋转3~6圈,缓慢抽出宫颈刷,置于装有细胞保存液的样本管中,于2~8℃冰箱保存备用。
  1.4 方法
  1.4.1 HPV分型检测 用PCR-反向点杂交法检测HPV,基本步骤为:①HPV DNA的提取;②PCR扩增;③杂交;④洗膜;⑤显色。所有操作步骤和结果判定均严格按试剂盒说明书要求进行。试剂盒检测的23种HPV分为高危型和低危型二类,其中高危型HPV有16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和82型,低危型HPV有6、11、42、43、81和83型。
  1.4.2 细胞因子检测 采用ELISA双抗夹心法检测宫颈细胞保存液中的IFN-γ、IL-4和IL-21含量。按照说明书步骤进行操作,在酶标仪上450 nm波长测定各孔OD值,结果判断时应将各试验孔OD值减去空白孔OD值。用试剂盒提供的标准品制作OD450值与浓度的标准曲线,计算出样本中IFN-γ、IL-4和IL-21的含量。
  1.4.3 阴道微生态指标检测 ①病原体检测:取阴道分泌物直接涂片,光学显微镜观察有无真菌和阴道滴虫感染;同时,将阴道分泌物涂片染色后镜检有无线索细胞,据此诊断细菌性阴道炎。②阴道清洁度检测:将阴道分泌物做生理盐水直接涂片、镜检,根据上皮细胞、白细胞、乳酸杆菌和杂菌数量比例分为Ⅰ~Ⅳ度,判定标准严格参照《全国临床检验操作规程》第四版[5]。③阴道pH值检测:采用精密pH试纸测定阴道分泌物的pH值。
  1.5 统计学方法
  采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t检验。采用Pearson线性相关分析方法作两变量间的相关分析。分类变量资料采用率或构成比来进行描述,组间比较采用χ2检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。
  2 结果
  2.1 HPV感染组型别分布情况
  根据该院各型HPV的检出情况,分别选择55例高危型HPV感染者和40例低危型HPV感染者作为试验组,其中高危型HPV组包括16、18、31、33、39、45、51、52、53、56、58、59、68和82型;低危型HPV组包括6、11、42、43、81和83型。
  2.2 三组IL-4、IFN-γ、IL-21含量比较
  三组人群的IFN-γ、IL-4和IL-21含量比较,差异均有统计学意义(P < 0.01)。其中,与对照组和低危型HPV组比较,高危型HPV组的IFN-γ和IL-21含量均降低,但IL-4含量升高,差异均有统计学意义(P < 0.01);与对照组比较,低危型HPV组的IFN-γ含量降低(P < 0.01),但两组的IL-4和IL-21含量比较,差异无统计学意义(P > 0.05)。见表1。
  2.3 三组IL-4、IFN-γ、IL-21指标的线性相关分析   高危型HPV组、低危型HPV组和对照组的IL-21与IFN-γ含量均呈正相关(P < 0.01),高危型HPV组的IL-21与IL-4、IL-4与IFN-γ含量均呈负相关(P < 0.05),低危型HPV组的IL-4与IFN-γ含量呈負相关(P < 0.01)。见表2。
  2.4 阴道微生态检测结果
  对高危型HPV组、低危型HPV组和对照组的阴道分泌物真菌、阴道滴虫、线索细胞、pH值和清洁度检查结果进行统计分析,三组间各指标的差异均无统计学意义(P > 0.05)。见表3。
  3 讨论
  HPV是一种无包膜的双链DNA病毒,现已发现100多个型别,其中至少有40余种亚型可造成女性生殖系统感染。现已证明,高危型HPV的持续感染是导致CIN及宫颈癌的重要因素[6-7]。HPV感染在有性活动的人群中较为常见,机体感染HPV后大部分情况下可清除病毒,是否发生持续感染及感染后的转归与机体的免疫功能密切相关,其中,阴道和宫颈黏膜免疫系统是机体抵抗HPV感染的一道重要防线,其功能受局部微生态系统、免疫细胞和细胞因子等多种因素影响[8-10]。因此,了解宫颈局部微环境改变有助于探讨HPV持续感染并导致CIN及癌变的可能机制,可为宫颈癌的防治提供新思路。
  本研究发现,与未感染HPV的对照组比较,高危型HPV感染者宫颈局部IL-4含量明显升高,而IFN-γ含量显著降低。在免疫应答过程中,IFN-γ和IL-4是二种重要的免疫效应分子,IL-4主要由Th2细胞分泌,能促进Th2细胞的增殖,发挥体液免疫效应,并抑制Th1细胞增殖;IFN-γ则主要由Th1细胞分泌,能促进Th1细胞的增殖,发挥细胞免疫效应,同时抑制Th2细胞增殖。因此,IFN-γ和IL-4含量的变化提示高危型HPV感染有可能导致Th1型细胞免疫应答向Th2型体液免疫应答漂移,这与其他研究[11-12]一致。
  Th1/Th2漂移的形成机制目前尚不明确。本研究发现,高危型HPV感染后宫颈局部IL-21含量降低,并与IFN-γ含量呈正相关,而与IL-4含量呈负相关。IL-21是IL-2细胞因子的一个家族成员,主要由活化的CD4+T细胞、滤泡辅助性T细胞、辅助性T细胞17、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)等免疫细胞分泌产生,也可由纤维细胞等非免疫细胞产生,其受体分布广泛[13],具有重要的免疫调节功能,能增强CD8+T细胞和NK细胞的细胞毒作用[14]、促进IFN-γ的分泌及抗体的产生,并有助于T细胞抵抗Treg细胞的免疫抑制作用,进而加强T细胞活性[15]。因此,宫颈局部IL-21减少提示患者的免疫调节功能出现异常,这可能是引起Th1/Th2漂移的原因之一,并由此导致IFN-γ的分泌减少、T细胞和NK细胞的细胞毒活性降低,使机体的抗病毒和抗肿瘤功能下降,进而引起HPV的持续感染和CIN。
  此外,与高危型HPV感染不同的是,低危型HPV感染后仅IFN-γ含量减少,而IL-4和IL-21含量无明显改变,提示机体的抗病毒功能虽有下降,但可能尚未出现明显的Th细胞漂移,因此更有利于机体清除病毒,不易出现HPV的持续感染。
  HPV的持续感染除与免疫系统密切相关外,还与阴道微生态系统有关[16-17]。本研究发现,高危型和低危型HPV感染者阴道局部真菌、阴道滴虫、线索细胞、pH值、清洁度等指标与对照组比较均差异无统计学意义(P > 0.05),这与其他报道[18-20]不尽相同。其原因可能是标本来源有差异,例如患者感染的HPV型别、年龄分布、标本的采集时间等都可影响实验结果,对此尚需做进一步研究。
  综上所述,HPV感染与宫颈免疫微环境之间相互作用、相互影响,高危型HPV比低危型HPV感染后更易引起宫颈局部IL-4和IFN-γ的表达异常,推测局部可能发生Th1/Th2漂移,其原因可能与具有免疫促进作用的IL-21低表达有关。局部细胞免疫功能下降有利于HPV的持续增殖,进而引起宫颈出现病理性改变甚至CIN。因此,维持宫颈局部正常免疫微环境、恢复机体的免疫调节功能对机体清除HPV和预防CIN具有非常重要的临床意义。
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  (收稿日期:2018-11-12 本文编辑:封 华)
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