EPF单抗联合顺铂对家畜膀胱肿瘤抑瘤效果的影响

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　　摘要：为观察早孕因子单克隆杭体（EPF-McAb）联合顺铂（DDP）对膀胱癌细胞EJ裸鼠移植瘤的抑制作用，常规将EJ细胞接种于裸鼠右侧背部皮下，待肿瘤长至直径约5mm时随机分为4组，每组5只，即空白对照组、顺铂组、低剂量单杭联合组和高剂量单杭联合组。定期测量裸鼠肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线。给药2周后处死裸鼠，剥取肿瘤，称瘤重，计算抑瘤率。通过苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin，HE）染色观察细胞病理学改变;免疫印迹法检测早孕因子（EPF）的表达情况。结果表明，顺铂组、低剂量单杭联合组和高剂量单杭联合组裸鼠移植瘤生长速度均慢于空白对照组。与顺铂组比较，低剂量单杭联合组和高剂量单杭联合组裸鼠末次给药的移植瘤体积分别为（131.05±8.26）和（97.92±7.35）mm3。低剂量单杭联合组抑瘤率（35.78%）和高剂量单杭联合组抑瘤率（53.04%）均高于顺铂组抑瘤率（22.36%），差异均达显著水平（P<0.05）。与空白对照组比较，单杭联合组裸鼠EPF蛋白的表达量下降（P<0.05）。表明EPF-McAb联合顺铂可抑制膀胱癌细胞EJ在裸鼠体内增殖，其机制可能通过抑制EPF的表达发挥作用。
　　关键词：早孕因子单克隆杭体（EPF-McAb）;顺铂;膀脱肿瘤;家畜
　　中图分类号：R739.5 文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）09-0133-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.028
　　一般来说，动物的膀胱肿瘤是比较罕见的，然而在世界的某些地区牛、羊等家畜的膀胱肿瘤却比较多见[1]。家畜中的膀胱癌是一种分化程度较低、具有高度浸润转移能力、预后差的恶性肿瘤[2，3]。大多数患有膀胱肿瘤或者尿道肿瘤的家畜都会出现血尿、尿频、痛性尿淋漓或排尿困难等症状，其他症状包括尿失禁、多尿、烦渴和呼吸困难等[4，5]。早孕因子（EPF）是在妊娠早期哺乳动物血清中存在的一种分泌性蛋白，由澳大利亚学者Morton在试验中发现并命名[6]。EPF不仅是正在分裂的胚胎和肿瘤组织的产物[7-9]，也是正在增殖的细胞的产物，胚胎和肿瘤的生长存活均有赖于EPF。因此，EPF具有免疫抑制活性、生长调节活性和免疫逃逸作用[10-12]。关于早孕因子单克隆抗体（EPF-McAb）联合顺铂（DDP）在动物体内对膀胱癌抑制作用的研究少见报道，本试验通过建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，研究EPF-McAb联合DDP的抗家畜膀胱肿瘤效应并初步探讨其作用机制，为EPF-McAb在家畜膀胱肿瘤治疗中的应用提供试验依据。
　　1 材料与方法
　　1.1 细胞株、动物及主要材料
　　人膀胱癌细胞EJ，中国科学院上海细胞库;6周龄SPF级BALB/c雄性裸鼠，广州中医药大学实验动物中心[许可证号：SCXK（粤）2013-0034]：顺铂，齐鲁制药有限公司;胎牛血清、DMEM及0.25%胰酶，Gibco公司;细胞裂解液、PMSF，上海碧云天生物技术有限公司;辣根酶标记山羊抗小鼠IgG，北京鼎国生物技术有限责任公司;苏木素，南京建成生物工程研究所有限公司;ECL发光液，美国millipore公司;β-actin抗体，Abeam公司：倒置显微镜，德国Leica公司;凝胶成像分析系统，美国Azure公司。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养和动物饲养 细胞培养于含10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃、饱和湿度、5%CO2孵箱中培养。BALB/c裸鼠饲养于无特定病原体（Specific pathogen free，SPF）环境中。
　　1.2.2 动物模型的建立、分组及给药 无菌环境下取对数生长期的EJ细胞0.25%胰酶消化后，制成密度为5×107个/mL的单细胞悬液，用注射器取0.2mL接种于裸鼠右侧背部皮下。7d后可见有移植瘤生长，随后每天用游标卡尺测量裸鼠移植瘤直径，待肿瘤长至直径约5mm后，将20只裸鼠随机分成4组，即空白对照组（生理盐水）、顺铂组（2mg/kg DDP）、低剂量单抗联合组（100μgEPF-McAb和2mg/kgDDP）、高剂量单抗联合组（300μgEPF-McAb和2mg/kg DDP），每组5只。尾静脉注射，隔天给药，共给药4次。
　　1.2.3 绘制肿瘤生长曲线 分组后每2d测量肿瘤直径1次，记录移植瘤的最大径（a）和最小径（b），计算肿瘤体积。肿瘤体积（mm3）=长径（a）×短径（b）2×π/6，记录至试验结束。根据各组肿瘤体积的平均值绘制肿瘤生长曲线。
　　1.2.4 计算抑瘤率 最后一次给药后第10天，颈椎脱臼法处死全部裸鼠，剥离瘤体并称瘤重，计算肿瘤的抑瘤率。抑瘤率=（1-治疗组平均瘤质量/空白组平均瘤质量）×100%。
　　1.2.5 组织形态学观察 切取肿瘤后，立即固定于10%中性甲醛溶液中，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，常规包埋蜡块，切片进行HE染色，光镜下观察肿瘤细胞数目、密度及坏死情况。
　　1.2.6 蛋白印迹试验 分别收集空白组和试验组细胞提取总蛋白，BCA法检测总蛋白浓度，加入loading buffer混合后沸水浴变性，經15%SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂牛奶封闭2h，EPF-McAb稀释度为1：1000，室温中孵育2h后洗膜，二抗孵育膜1h，再次洗膜后采用ECL在暗室中显色，X光胶片记录阳性条带，扫描后用gel pro 4.0软件分析阳性条带灰度值，以EPF与β-actin灰度值的比值为EPF蛋白相对表达量。
　　1.3 统计学分析
　　应用SPSS17.0统计软件对资料进行处理分析。所有计量资料均符合正态分布，以平均值士标准误（x±s）表示;计量资料间比较，在确定方差齐性后（P>0.05），采用单因素方差分析（One-way ANO-VA），各组间的多重比较采用Bonferroni法;如果方差不齐（P<0.05）则采用Welch法，组间多重比较采用Dunnett's T3法。P<0.05为差异具有统计学意义。 　　2 结果与分析
　　2.1 裸鼠移植瘤体积和肿瘤生长情况
　　由图1可见，接种后，各治疗组移植瘤均表现为体积增大，呈局部结节状生长。空白对照组、顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠肿瘤体积平均分别为（1071.40±116.31）、（831.05±53.24）、（702.13±29.75）和（503.59±47.81）mm3。顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠的移植瘤生长速度均显著慢于空白对照组（P<0.05）。
　　2.2 裸鼠肿瘤质量和抑瘤率
　　最后一次给药后第10天处死裸鼠，解剖见肿瘤表面包膜完整，呈结节状或类圆形，空白对照组、顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠肿瘤质量分别为（2.102±0.141）、（1.632±0.118）、（1.350±0.071）和（0.987±0.056）g;顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组的抑瘤率分别为22.36%、35.78%、53.04%，与空白对照组比较差异均显著（P<0.05）（表1）。
　　2.3 HE染色观察EPF-McAb联合顺铂对裸鼠皮下移植瘤形态的影响
　　镜检结果可见，空白对照组裸鼠肿瘤细胞间隙较小，分布均匀，但排列紊乱，具有明显的核异型性、核分裂多、细胞核大、胞质较少等特点。低剂量单抗联合组及高剂量单抗联合组与顺铂组相比，病理可见肿瘤细胞大小不均，细胞间隙较大，形态不整，细胞核固缩，核分裂相对较少，可见有少量炎性细胞浸润，肿瘤细胞坏死明显，细胞增殖被抑制（图2）。
　　2.4 EPF蛋白表达
　　由图3可见，空白对照组、顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组裸鼠EPF蛋白表达灰度值分别为101.05、75.46、31.37、16.71;顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组与空白对照组相比差异均达显著水平（P<0.05）。
　　3 小结与讨论
　　家畜中的膀胱肿瘤是一种分化程度较低、具有高度浸润转移能力、预后差的恶性肿瘤[2，3]，家畜疾病的防治工作直接影响养殖户的收入及养殖业的发展水平[13]。研究发现抗EPF-McAb对小鼠体内移植瘤生长有影响[14]，抗EPF-McAb无论在体外或体内均可抑制肿瘤的生长[14]。本试验通过建立膀胱癌裸鼠移植瘤模型，尾静脉给药后，绘制肿瘤生长曲线，观察抑瘤效果;通过苏木精-伊红（Hematoxylin-eo-sin，HE）染色观察细胞病理学改变;免疫印迹法检测EPF蛋白的表达情况，了解EPF-McAb联合顺铂对裸鼠膀胱肿瘤的抑瘤效果。结果表明，EPF-McAb联合顺铂可抑制膀胱癌细胞EJ在裸鼠体内增殖，其机制可能通过抑制EPF蛋白的表达发挥作用，为进一步探究家畜膀胱肿瘤的治疗奠定了基础。
　　张冬云等[9]在肺癌等多种肿瘤或非肿瘤患者的血清中发现，绒癌、膀胱癌、黑色素瘤、恶性葡萄胎4种肿瘤血清和黑色素瘤标本组织液具有t-EPF活性，故猜测EPF-McAb可能对膀胱肿瘤有治疗作用。在本试验中，随EPF-McAb剂量的增加肿瘤的体积及质量逐渐减小，顺铂组、低剂量单抗联合组和高剂量单抗联合组的抑瘤率分别为22.36%、35.78%、53.04%，表明不同浓度的EPF-McAb有显著抑制肿瘤生长的作用，抑瘤效果较顺铂组更为显著，且随着EPF-McAb剂量的增加，对肿瘤的抑制作用逐渐增强，抑制作用与浓度呈明显的相关性，这与Quinn等[15]的试验结果一致，表明EPF-McAb对膀胱癌有很好的治疗作用。
　　已有较多报道显示单抗联合临床药物对裸鼠移植瘤的生长有抑制作用。张皓等[16]提出，曲妥珠单抗联合吉西他滨可以有效抑制裸鼠移植瘤生长，其机制可能与下调Cox-2蛋白表达有关;此外，梁亮等[17]发现，西妥昔单抗联合伊马替尼可以下调ATP7A、p-Akt、p-mTOR蛋白表达，同时明显降低结肠癌大鼠血清VEGF含量，进而影响结肠癌组织中的能量合成，抑制肿瘤细胞的增殖;祝保艳等[18]则表示卡博替尼联合PD-L1单抗对黑色素瘤小鼠移植瘤有抑制作用，这种协同抗肿瘤作用机制可能是通过促进 B16-F10细胞凋亡及抑制AKT/mTOR通路所致。而在本研究中，EPF-McAb联合顺铂可以明显抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生长，与上述研究结果一致。
　　有研究显示，EPF-McAb使肿瘤细胞体外生长受到限制，可能是由于EPF-McAb干扰了维持肿瘤细胞增殖活性阶段的机制[14]。EPF具有免疫抑制作用，主要抑制淋巴细胞功能，而且EPF与肿瘤生长有关[15，19]，利用EPF-McAb结合EPF蛋白，可能减轻EPF对免疫系统的抑制作用，从而抑制EJ细胞的增殖。故单抗联合药物对肿瘤的治疗具有一定理论和试验依据。对于家畜来说，若能科学地使用和掌握药物，就能有效地治疗家畜养殖中遇到的相关疾病，有助于家畜的健康成长，并提升其经济效益[20]。
　　综上所述，本研究结果表明EPF-McAb联合顺铂可抑制膀胱癌细胞EJ在裸鼠体内增殖，其机制可能通过抑制EPF蛋白的表達发挥作用。本试验结果为EPF-McAb治疗家畜膀胱肿瘤提供了一定的理论依据。
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　　收稿日期：2019-05-30
　　基金项目：广东省科技计划重点项目（2008A030201022）
　　作者简介：钟永怡（1993-），女，广东清远人，在读硕士研究生，研究方向为公共卫生与预防医学，（电话）13678920392（电子信箱）zhongyon-gyi1993@163.com;通信作者，王家骥（1955-），男，广东广州人，教授，硕士生导师，主要从事全科医学研究，（电话）13926179883（电子信箱）wjiaji@163.com;陈骁熠（1965-），女，广东广州人，教授，硕士生导师，主要从事食品与营养卫生研究，（电话）18620586562（电子信箱）wwchenxyl@163.com。
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