转华山新麦草果聚糖合成酶基因对烟草相关生理指标的影响

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　　摘要：以转华山新麦草果聚糖合成酶基因（HS-6-SFT）烟草和非转基因烟草W38为材料，在4℃低温下对其胁迫8h，分析转HS-6-SFT基因烟草和非转基因烟草的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性和可溶性蛋白质含量的变化。结果表明，在低温胁迫下烟草叶片中的SOD活性、CAT活性、POD活性和可溶性蛋白质含量均有所增加，且增加的幅度要大于常温处理，并且在转基因材料和对照之间存在极显著差异（P<0.01）。转HS-6-SFT基因增强了烟草的杭逆性。
　　关键词：转基因烟草;超氧化物歧化酶（SOD）;过氧化氢（CAT）;过氧化物（POD）;可溶性蛋白质;低温胁迫
　　中图分类号：S572 文献标识码：A
　　文章编号：0439-8114（2020）09-0095-04
　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.09.019
　　果聚糖（fructans）为水溶性的非还原性多糖，是由蔗糖与1个或多个果糖基相连接而形成的聚合物，广泛存在于各种真菌、细菌和植物中。植物是果聚糖的主要来源，目前已发现植物的果聚糖主要有5种类型[1]。果聚糖是植物体内一种贮藏性碳水化合物，同时也具有渗透调节作用，与植物的抗逆性密切相关。
　　将来自微生物的果糖基转移酶基因（SacB基因）转入烟草（Nicotiana tobacum）、甜菜（Beta vulgar-is）、小麦（Triticum aestivum）、番茄（Lycopersicon escul-entum）后，植株的抗寒性[2-4]、耐盐性[5]和抗旱性[6-8]均明显提高。王关林等[4]将果聚糖合成酶基因转入番茄，利用Southern、RT-PCR等技术对转基因植株进行检测，结果表明果聚糖合成酶基因的转入增强了转基因番茄的抗寒性。刘伟华等[7]以来自枯草杆菌的果糖基转移酶基因SacB基因转化小麦，获得了耐旱性增强的转基因植株，表明细菌来源的SacB基因能够提高小麦的耐旱性。Kawakami等[9]将小麦中wft1（1-FFT）基因和wft2（1-SST）基因转入水稻，结果在转基因水稻植株的成熟叶片中发现了大量的果聚糖积累，并在幼苗时期表现出较强的抗寒性。另有研究者将从莴苣中克隆的1-SST基因转入烟草，发现转基因烟草植株抗旱性和抗寒性均明显提高[10]。
　　随着植物中第一个果聚糖合成酶基因在大麦中成功克隆，已在多种植物中克隆了果聚糖合成酶基因，并进行了相关功能验证叫。但是，鲜见有关华山新麦草6-SFT蔗糖：果聚糖-6-果糖基转移酶基因）基因在干旱和寒冷胁迫抗性中的作用及其转基因植株在逆境胁迫下的生理生化反应的报道。为此，本研究以转化小麦近缘属华山新麦草6-SFT基因烟草为材料，通过低温胁迫处理，旨在了解转HS-6-SFT基因烟草其抗逆性是否增强。
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料
　　转HS-6-SFT基因烟草为陕西省植物遗传工程育种重点实验室保存，以非转基因烟草W38作为对照。试验在西北农林科技大学农学院进行。
　　1.2 材料的选取
　　将大小基本一致的阳性转基因植株和对照植株移栽至10cm×10cm塑料盆中。每个品种各栽5株，待植株长至3～5片真叶时，在4℃低温下对其胁迫8h，取处理烟草第三和第四片叶速冻于液氮中，储存于-80℃的冰箱中备用。每个样本测3次，各指标取3次测定的平均值。
　　1.3 生理生化指标测定
　　过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和可溶性蛋白质的测定分别采用愈创木酚法、紫外吸收法、氮蓝四唑法和考马斯亮蓝G-250法[12]。
　　1.4 数据处理与分析
　　用Excel软件进行基础数据的输入、作图，采用SPSS软件进行方差分析。
　　2 结果与分析
　　2.1 烟草中可溶性蛋白质含量的变化
　　烟草中可溶性蛋白质含量变化如图1。从图1可以看出，在4℃低温胁迫处理下，转HS-6-SFT基因烟草和对照可溶性蛋白质含量都增加。在25℃下转HS-6-SFT基因烟草和对照可溶性蛋白质含量差别不大，但4℃低温下转HS-6-SFT基因烟草可溶性蛋白质含量是25℃下的2.29倍，对照可溶性蛋白质含量是25℃下的2.19倍。在4℃低温下转基因烟草的可溶性蛋白质含量与对照差异极显著（P<0.01）。可溶性蛋白质含量与植物的抗寒性密切相关，在低温胁迫处理下转基因烟草可溶性蛋白质含量明显提高，使其细胞液浓度升高，由此说明转HS-6-SFT基因烟草的抗寒性提高了。
　　2.2 烟草中POD活性的变化
　　由图2可以看出，在4℃低温处理下转HS-6-SFT基因烟草和对照POD活性都有增加。在25℃下转HS-6-SFT基因烟草和对照POD活性差别不大，但4℃低温下转HS-6-SFT基因烟草POD活性是25℃下的2.46倍，对照POD活性是25℃下的1.50倍。在4℃胁迫时转基因烟草POD活性与对照差异极显著（P<0.01）。在低温、干旱和盐渍等条件下植物体内会产生大量的H2O2，这些H2O2由于比较活泼的化学性质结合体内的自由基而产生一些过氧化物，从而对植物体产生伤害，而POD可以清除体内产生的自由基和过氧化物，分解植物体内的H2O2，避免细胞膜受到伤害，减轻H2O2对植物的伤害，由此说明低温胁迫可导致转HS-6-SFT基因烟草POD活性增加。
　　2.3 烟草中SOD活性的变化
　　由图3可知，在4℃低温处理下转HS-6-SFT基因烟草和对照SOD活性都有增加。在25℃下转基因烟草和对照SOD活性基本在一個水平，但4℃低温下转HS-6-SFT基因烟草SOD活性是25℃下的2.78倍，对照SOD活性是25℃下的1.24倍。在4℃胁迫时转基因烟草SOD活性与对照差异极显著（P<0.01）。SOD在植物体内保护酶系统中是最重要的保护酶之一，在低温胁迫下SOD作为植物抗寒性的重要指标，SOD活性越高表明该植物的抗寒性越强，SOD活性越低表明该植物的抗寒性越弱，由图3可知，转HS-6-SFT基因烟草在低温处理下SOD活性增强，由此表明转入的HS-6-SFT基因提高了烟草的抗寒性。 　　2.4 烟草中CAT活性的变化
　　转基因烟草CAT活性变化如图4。从图4可以看出，在4℃低温处理下转HS-6-SFT基因烟草和对照CAT活性都有所增加。在25℃下转基因烟草和对照CAT活性基本在一个水平，但4℃低温下转HS-6-SFT基因烟草CAT活性是25℃下的1.77倍，对照CAT活性是25℃下的1.10倍。在4℃胁迫时转基因烟草的CAT活性与对照差异极显著（P<0.01）。在低温逆境胁迫下，大量的活性氧在植物体内产生，形成过氧化环境，氧具有非常活泼的化学性质，氧所催化的化学反应会对细胞产生损伤，因此及时清除活性氧可以提高植物的抗逆性，由此说明转HS-6-SFT基因烟草抗逆性有所提高。
　　3 小结与讨论
　　Hisano等[13]利用基因枪法将小麦中的果糖基合成酶基因转入多年生黑麦草中，结果表明转基因黑麦草表现出较高的抗寒性。Kawakami等[9]将小麦中的1-SST基因和6-SFT基因利用农杆菌介导法转入水稻，在转基因水稻叶中检测到果聚糖的存在，对转基因水稻和对照进行冷害处理，对照存活率低于10%，而所有转1-SST株系及一个转6-SFT株系水稻存活率均高达40%～90%。李慧娟等[10]、Li等[14]将从莴苣中克隆的1-SST基因转入烟草，结果表明耐旱性及其抗冻性显著提高，表明转1-SST基因烟草植株积累了果聚糖。本研究将小麦近缘属华山新麦草6-SFT基因转入到烟草中，转基因烟草植株表现出较强的抗旱和抗低温能力，进一步表明来自小麦近缘属华山新麦草的果聚糖合成酶基因的过表达可以提高植物的抗逆性，这将为利用生物技术手段改良小麦的抗逆性提供新的理论和方法。
　　试验结果表明，转HS-6-SFT基因烟草一方面通过增强渗透调节物质（可溶性蛋白质）的含量，保持原生质体与环境之间的渗透平衡和结构的完整性[15];另一方面增加SOD、POD等活性氧清除酶的活性，清除自由基，减少活性氧的积累，从而降低了低温胁迫下烟草幼苗叶片膜质过氧化产物MDA的生成量[16，17]。在不同低温处理条件下，转基因烟草和对照之间各项生理生化指标的差异均达到极显著水平。这些结果与转基因烟草耐寒性的提高相吻合。
　　在小麦中，Tognetti等[18]研究表明冬小麦中抗寒性强的品种果聚糖含量是抗寒性弱品种的3倍左右，在低温下，果聚糖更容易合成。Albrecht等[19]对小麦的研究发现，渍水胁迫持续6d后，小麦根中果聚糖积累量是对照的18倍。Kawakami等[11]的研究发现，抗冻性强的小麦品种积累的果聚糖更多，充分表明果聚糖的累积可以增强小麦的抗寒性。叶兴国等[20]研究发现在水分胁迫处理前15d内植物体内有较少的果聚糖积累量，水分胁迫21～28d果聚糖积累开始增加，随着复水后干旱胁迫解除，果聚糖含量下降。综上所述，果聚糖在植物体内的有效积累可提高小麦的抗旱能力。殷桂香等[21]选用8个小麦基因型进行干旱胁迫处理，结果表明，干早胁迫期间扬麦6号叶片中果聚糖含量明显高于其他基因型叶片中果聚糖含量，其在干旱条件下植株存活率显著高于其他几个基因型小麦品种。
　　本研究结果表明，HS-6-SFT基因的表达及果聚糖在转基因烟草植株中的积累，使转基因植株中可溶性蛋白质、SOD和POD含量增加。可溶性蛋白质、SOD、POD是植物细胞内比较重要的渗透调节物质，这些物质具有增加细胞质浓度和防止细胞过度脱水的作用，從而可以减少逆境条件下的氧化胁迫损伤。然而积累果聚糖的转HS-6-SFT基因烟草具体如何调控植株的生理体制机制，还需要进一步研究。
　　与传统的杂交育种相比，转基因育种具有育种目的明确和育种年限短等突出优点。另一方面，随着全球气候的极端变化，对重要粮食作物如小麦、玉米、水稻等作物的生长发育及其产量形成都造成了严重影响，因而通过分子生物学途径导入相关抗逆基因来改良作物的的抗逆性受到普遍重视。本研究克隆的来源于小麦近缘属华山新麦草6-SFT基因在烟草中的逆境胁迫耐性研究，证实6-SFT是一个与植物逆境耐性相关的基因，可为以后的小麦抗逆育种提供有用的基因资源。
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　　收稿日期：2019-08-23
　　基金项目：国家科技支撑计划项目（2015BAD26B01）;2018年河南省重大科技专项（181100110200）;河南省小麦产业技术体系支持项目（Z2010-01-01）;国家小麦产业技术体系支持项目（CARS-03）
　　作者简介：陈真真（1990-），女，河南驻马店人，助理研究员，硕士，主要从事小麦育种研究，（电话）15225361201（电子信箱）396939159@qq.com。
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