苗药痛风停对痛风性关节炎模型大鼠炎症因子及滑膜病理的影响

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　　【摘 要】 目的：探讨苗药痛风停方对痛风性关节炎模型大鼠炎症因子及关节滑膜组织病理形态的影响。方法：建立痛风性关节炎大鼠模型，分设模型对照组、空白对照组、痛风停低、中、高剂量组和秋水仙碱组，每组12只大鼠，空白对照组及模型组以等量生理盐水灌胃，其余各组予等容积相应药物灌胃，连续给药5d后收集标本。观察大鼠一般状况表现，检测外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8浓度，大鼠关节滑膜组织进行病理染色检测。结果：①模型组大鼠明显动作迟缓，反应迟钝，活动量明显减少，食量减少，精神萎靡，毛发无光泽。与模型组相比，痛风停汤中、高剂量组与秋水仙碱组大鼠一般情况均较治疗前明显改善，关节肿胀减轻，进食量较多，反应良好，活动量接近正常。②模型组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α显著升高（P<0.05），与模型组比较，痛风停低、中、高剂量组及秋水仙碱组血清炎症因子均有不同程度降低（P<0.05），其中痛风停高剂量组炎症因子浓度低于秋水仙碱组（P<0.05）。③模型组滑膜组织增厚，大量淋巴细胞浸润，血管增生;与模型组比较，痛风停低剂量组滑膜增生、淋巴细胞浸润均较轻，痛风停中、高剂量组滑膜增生则不明显，淋巴细胞浸润显著减少，秋水仙碱组与痛风停低剂量组改变近似。结论：苗药痛风停可以降低血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α浓度，抑制关节滑膜炎症增生，有效控制关节炎症。
　　【关键词】 苗药痛风停;痛风性关节炎;动物模型;炎症
　　【中图分类号】R29   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2019）24-0023-04
　　痛风性关节炎（goutyarthritis，Gout）是尿酸盐晶体沉积于人体内所导致的一种炎性疾病，急性期以关节红、肿、热、痛为主要临床特征，最终可导致关节变形、骨骼损毁，甚则等影响到内脏器官功能，出现肾功能衰竭[1]。研究显示尿酸盐结晶作为炎症激发因子，通过Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）/髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）信号途径诱导炎症反应，机体生成白细胞介素（Interleukin，IL）、肿瘤坏死因子ɑ（Tumor necrosis factor，TNF-ɑ）等多种细胞因子，导致炎症瀑布反应[2]。《丹溪心法》中记载：“痛风者，四肢百节走痛，方书谓之白虎历节风证是也”，认为是风、热、痰、湿相互胶结为患，阻滞经脉气血所致;苗医认为痛风属“热经病”，多由于“风、热、火、湿”等邪气炽盛、血脉受阻，邪毒留滞筋骨所致，其认识与祖国医学殊途同归。治疗用药上多以流转气血、清热解毒、去除邪热为法，达到“赶邪”的目的。我科于临床中借鉴中医、苗医理论研创了“痛风停”方，该方中三七草、大泽兰、田七草、观音草、芭蕉根等药物属苗医药范畴，能“赶邪祛毒、行血消肿”，配合石膏、虎杖、黄柏等药物，达到活血散结、清热解毒、利水消肿的目的，临床中发现苗药“痛风停”方能较好的减轻痛风性关节炎急性期炎性肿胀、疼痛。本研究通过建立大鼠痛风性关节炎模型，观察痛风停对血清TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等炎症因子及关节滑膜组织的影响，探讨苗药痛风停方对痛风关节炎的抗炎作用机理。
　　1 实验材料
　　1.1 实验动物及分组 成年雄性SD大鼠72只，清洁级，体重（240±20）g，购置于重庆腾鑫生物技术有限公司，证号SCXK（京2013-0007）。所有动物饲养于贵阳中医学院实验动物中心，同等饲养条件。按随机数字分组方法分为空白对照组、模型对照组、痛风停低剂量组、中剂量组、高剂量组和秋水仙碱对照组共6组，每组12只。
　　1.2 主要材料及设备 实验药物苗药痛风停汤由三七草（锐徒清）30g、大泽兰（锐米菜）15g、田七草（锐天梯）15g、观音草（锐油沙）15g、芭蕉根30g等药物组成（由贵州中医药大学第二附属医院提供）。对照药物秋水仙碱片（北京嘉林药业股份有限公司，批号：20161001）;尿酸钠（美国Sigma公司，批号：U2875-5G）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号P0010S）;DBA、PV-9000（北京中杉金桥生物）;IL-1、IL-6、IL-8检测ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究院）;切片机（德国莱卡，型号：RM2015），显微镜（日本奥林巴斯，型号：BX51T-PHD-J11）;低温高速离心机（SCILOGEX，型号：D3024R）;自动酶标读数仪（美国BioTek公司）;脱色摇床（国立常州试验设备研究所）;超净工作台（苏洁净化有限公司）。
　　2 实验方法
　　2.1 药物制備 将上述苗药加水1000mL浸泡1h后煎煮30min，再加水500ml煎煮30min，两煎混合过虑后浓缩至含生药物1g/mL，储存备用。秋水仙碱取适量加蒸馏水配置成1g/mL混悬液，储存待用。
　　2.2 造模方法 按照Mc Carty DJ的造模方法[4]，除空白对照组外，其余各组实验动物用20%乌拉坦（5mL/kg静脉注射）麻醉，然后将大鼠双侧膝关节周围脱毛，消毒皮肤，轻弯曲膝关节，于关节正中或侧方进针，用6号注射针将尿酸钠溶液10mg（0.4mL）及多粘菌素B 0.1mL（10U/mL）注入大鼠膝关节腔，制备急性痛风性关节炎动物模型。造模成功后，病变关节明显肿胀、发热，患肢活动受限。
　　2.3 给药方法 痛风停方的成人（60kg）每日剂量为生药1.25g/kg，根据人与大鼠体质量确定大鼠的等效剂量为中剂量（7.5g/kg），等效剂量的1/2倍为低剂量（3.75g/kg），等效剂量的2倍为高剂量（15g/kg）。阳性药对照组秋水仙碱取等效剂量30mg/kg[5]。从造模第1天开始，连续灌胃7d，每天分2次给药，模型对照组和空白对照组灌服等量生理盐水。 　　2.4 观测指标
　　2.4.1 各组大鼠一般情况观察，包括活动、精神状态、毛发、进食、反应能力等方面。
　　2.4.2 外周血TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8浓度检测 股动脉采集外周血，离心后收集血清送检，使用ELISA检测方法对TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8进行检测，严格按照ELISA试剂盒操作说明书步骤进行操作。
　　2.4.3 关节滑膜组织病理检测 取各组大鼠膝关节滑膜组织，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片，常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇处理至水洗，然后染色、固定。具体操作步骤严格参照实验步骤进行。
　　2.5 统计方法 采用SPSS22.0软件分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验、秩和检验。所有的统计检验均采用双側检验，P<0.05为差异具有统计意义。
　　3 结果
　　3.1 一般情况 成功复制痛风性关节炎大鼠模型，模型组大鼠明显动作迟缓，反应迟钝，活动量明显减少，食量减少，精神萎靡，毛发无光泽。与模型组相比，痛风停汤中、高剂量组与秋水仙碱组大鼠一般情况均较治疗前明显改善，进食量较多，反应良好，活动量接近正常。
　　3.2 痛风停方能够降低模型大鼠外周血IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的浓度 比较各组大鼠外周血检测结果，与空白组比较，造模组大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、 TNF-α显著升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，痛风停低、中、高剂量组及秋水仙碱组均有显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）;痛风停高剂量组检测结果低于秋水仙碱组，差异有统计学意义（P<0.05）。详见表1。
　　3.3 各组大鼠关节滑膜病理 与空白组比较，模型组滑膜组织增厚，大量淋巴细胞浸润，血管增生;与模型组比较，痛风停低剂量组滑膜增生、淋巴细胞浸润均较轻，痛风停中、高剂量组滑膜增生则不明显，淋巴细胞浸润显著减少，秋水仙碱组与痛风停低剂量组改变近似。如图1～6所示。
　　4 讨论
　　痛风性关节炎患病率逐年增加，发病年龄也趋向年轻化，而尿酸盐是炎症诱发的启动因素。研究显示痛风的发生机制较多，其中TLRs/MyD88炎症通路较为集中[6]。机体内尿酸盐晶体暴露后诱导TLRs/MyD88通路激活，触发组织细胞释放炎症因子TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8、干扰素γ等，诱使中性粒细胞脱颗粒和单核巨噬细胞聚集、吞噬[7-10]，并激活NF-κB炎症通路[11]，使炎症反应持续放大。
　　IL是一类具有多重功效的细胞因子，可由多种细胞产生，在炎症的发生、发展中起着重要作用。IL-1是一种由单核细胞、巨核细胞分泌，常常和TNF-α共同发挥“核心”致炎的作用，是痛风主要的促炎因子[12];同时IL-1还诱导内皮细胞表达粘附因子，使白细胞聚集于关节腔内[13]。IL-6主要由内皮细胞、单核细胞等产生，并刺激B细胞产生抗体，以激活效应性T细胞，还可以诱导血管上皮细胞形成血管翳，激活血管内皮细胞上的粘附因子[14]。IL-8是一种趋化性细胞因子，主要是由单核细胞、上皮细胞等分泌，参与炎症和体内的免疫防御反应。研究证实[15-16] 上述三种白介素在痛风性关节炎的炎症发生、发展中起着重要作用。TNF-α主要由单核/巨噬细胞产生，是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质，能激活中性粒细胞和淋巴细胞，调节并促使其他细胞因子的合成和释放[17]，与IL-l、IL-6、IL-8形成联动，诱导炎症呈瀑布样发展。因此，我们认为TNF-α、IL-l、IL-6、IL-8等炎症因子是在痛风性关节炎炎症反应急剧发生发展的重要介质，对上述炎症介质的抑制，是有效减轻痛风炎症的手段。
　　苗医理论认为痛风关节炎是由于各种原因导致“邪毒”、“风毒”、“火毒”及“瘀毒”等侵袭所引起，属于“热经病”范畴，治疗当予“赶毒”（玛汝务翠）为法，痛风停方源于苗族经验方，由三七草（锐徒清）、大泽兰（锐米菜）、田七草（锐天梯）、观音草（锐油沙）、芭蕉根、虎杖、生石膏、黄柏等组成，全方具有祛邪解毒、活血化浊、清热利水、消肿散结之效，可有效减轻痛风患者关节疼痛，可有效降低患者炎症指标[18-19]。本实验结果显示，造模大鼠血清IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α浓度显著升高，且滑膜组织增生、淋巴细胞浸润，经苗药痛风停治疗后，能减轻大鼠关节炎症反应，显著降低外周血中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的浓度，并抑制关节滑膜细胞增殖，充分说明苗药痛风停通过抑制机体多种炎症因子的释放，从而控制痛风性关节炎的炎症反应。
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　　（收稿日期：2019-10-10 编辑：刘斌）
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