天麻素对阿尔茨海默病小鼠的脑内氧化应激及tau蛋白磷酸化的影响

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　　[摘要] 目的 研究天麻素對AD模型小鼠脑内氧化应激及tau蛋白磷酸化水平的影响。 方法 实验分为正常对照组、AD模型组（tau 转基因小鼠）和天麻素治疗组，治疗组小鼠选取tau转基因小鼠，隔日给予天麻素[5 mg/（kg·d）]灌胃处理3个月，对照组和模型组小鼠（tau转基因小鼠）则均给予生理盐水灌胃处理。通过分子生物学及形态学相关技术检测各组小鼠脑内p-tau202磷酸化水平及CHAT的表达;并考察氧化应激相关指标的变化。 结果 Western blot及免疫荧光结果显示，模型组小鼠脑内p-tau202的表达高于对照组小鼠，而天麻素治疗组小鼠脑内p-tau202的表达水平较模型组小鼠降低;氧化应激结果显示，天麻素干预处理后，小鼠脑内的MDA含量降低，SOD活性明显升高;Western blot结果显示，与模型组小鼠相比较，天麻素治疗组小鼠脑内CHAT表达水平降低。 结论 天麻素能够通过减少氧化应激进而降低AD模型小鼠脑内tau蛋白的磷酸化水平，最终起到对神经元的保护作用。
　　[关键词] 天麻素;阿尔茨海默病;tau蛋白磷酸化;氧化应激;保护作用
　　[中图分类号] R285          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）17-0033-04
　　The effect of gastrodin on oxidative stress and tau protein phosphorylation in the brain of the mice with Alzheimer's disease
　　ZHANG Hao1   BIAN Shiyu2   GAO Fei1   WANG Yingbin1
　　1.Department of Neurosurgery，Division Ⅱ，Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College，Shenyang   110024，China;2.Biotechnology Major，China Medical University，Shenyang   110024，China
　　[Abstract] Objective To mainly study the effect of gastrodin on oxidative stress（OS） and tau protein phosphorylation in the brain of the AD model mice. Methods In the experiment，the subjects were divided into the normal control group，the AD model group（tau transgenic mice）and the gastrodin intervention group. Tau transgenic mice were selected into the intervention group， which received gastrodin[5 mg/（kg·d）] in the form of intragastric administration every other day for 3 m， while normal saline was administrated in intragastric form to the mice in the control group and the AD model group（tau transgenic mice）. The p-tau202 phosphorylation level and the expression of CHAT in the brain of each group of mice were detected by the relevant techniques of molecular biology and morphology， and the changes of OS related indexes were also investigated. Results Western blot and immunofluorescence results showed that the p-tau202 expression in the brain of tau transgenic mice was higher than that in the brain of the mice in the control group， while the p-tau202 expression level in the brain of the mice in the gastrodin intervention group was lower than that of tau transgenic mice. OS results showed that after gastrodin intervention， MDA content in the brain of the mice decreased and SOD activity significantly increased. Western blot results showed that compared with that of the mice in the AD model group，the CHAT expression level in the brain of the mice in the gastrodin intervention group decreased. Conclusion Gastrodin can reduce the phosphorylation level of tau protein in the brain of AD model mice by reducing OS，and ultimately play a protective role on neurons. 　　[Key words] Gastrodin; Alzheimer's disease（AD）; Tau protein phosphorylation; Oxidative stress（OS）; Protective role
　　阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是由德国学者Alois Alzheimer发现的一种中枢神经系统变性病，迄今为止已有100多年的研究历史[1-2]。如今，AD发病率逐年上升，并已成为世界上最常见的痴呆类型[3-4]。AD的主要病理特征主要体现在两方面：①大脑皮质、海马、杏仁核和丘脑中出现大量β-淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）沉积形成的老年斑（Senile plaque，SP）;②大脑皮质和海马存在大量由tau蛋白过度磷酸化进而形成的神经纤维缠结（Neurofibrillary tangles，NFTs）[5-7]。AD发病的确切原因尚不清楚，发病机制复杂，其病因与多种因素有关。研究表明，氧化应激损伤参与AD的发病过程，并在AD发病机制的众多学说中，氧化应激学说与其他诸多假说之间存在间接或直接的联系。
　　天麻素（Gastrodin/gastrodine，GAS）是中药天麻块茎的主要成分之一。研究表明，GAS在镇静、镇痛、抗炎、抗氧化自由基等多方面功效明显，令人感兴趣的是，在体内实验中发现，GAS不仅能够保护神经元，而且还可以抑制神经胶质细胞的活化，减少 Aβ老年斑沉积，有效改善学习记忆功能障碍[8-9]。上述结果证实GAS在AD防治方面具有重要的理论意义，但GAS对 AD小鼠脑内tau蛋白磷酸化的影响及其作用途径和机制目前尚未清楚。
　　为此，本实验应用3月龄tau 转基因小鼠，采用相关实验技术，检测天麻素对tau转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化水平的影响，并考察各组小鼠氧化应激相关指标的变化，最后通过Western blot方法检测小鼠脑内CHAT的表达，有望将天麻素作为防治AD的新靶点，为延缓AD发病进程奠定实验基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料来源
　　1.1.1 實验药品  天麻素（成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-18030827），CHAT（abcam，货号：ab181023），β-actin（Cell Signaling Technology，货号：4970s），鼠抗tau（Cell Signaling Technology，货号：4019s）、兔抗p-tau Ser 202（Cell Signaling Technology，货号：39357s），ECL试剂盒（Pierce，CA货号：BTB320098），荧光二抗（ThermoFisher，货号：A-11037），蛋白marker（ThermoFisher，货号：26616），丙二醛（MDA）试剂盒（齐一生物科技有限公司，货号：QYS-23035），超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（齐一生物科技有限公司，货号：JK5301）。
　　1.1.2 主要仪器  离心机（美国Beckman Allegra X-30R），水平摇床（捷星实验仪器），Bio-RAD酶标仪（美国Bio-Rad iMark），BIO-RAD凝胶图像分析系统（美国Bio-Rad ChemiDoc XRS+），台式高速离心机（Genespeed），激光共聚焦显微镜（德国Leica公司TCS SP8）。
　　1.1.3 实验动物  3月龄tau转基因小鼠（Stock Number 008169）和C57BL/6由中国医科大学病理生理实验室提供。体重为15～22 g，实验所用小鼠均按照组别分笼饲养，每笼3只，自由饮食水，动物房的室内温度保持在20°C～25°C。
　　1.1.4 动物分组及给药处理   称取 200 mg天麻素于高压过的 EP 管中，向其中加入1 mL的生理盐水溶解，使其终浓度为 200 mg/mL备用。
　　小鼠出生后1个月，提取鼠尾DNA，PCR鉴定出tau转基因小鼠，同时，通过剪指甲的方式将小鼠标记序号。实验开始前，根据SPSS统计学软件产生的随机数字分为AD模型组（tau转基因小鼠）和天麻素治疗组（tau转基因小鼠+天麻素干预），每组小鼠随机选取15只，同背景同月龄C57BL/6小鼠15只，设为正常对照组。具体给药方式如下所示：对照组和tau转基因组小鼠，隔日给予生理盐水灌胃处理;天麻素治疗组小鼠，将tau转基因小鼠按隔日给予5 mg/（kg·d）天麻素灌胃，时间均为3个月。
　　1.2 方法
　　1.2.1 小鼠脑组织取材  每组小鼠CO2吸入麻醉，仰放在灌流操作台上，剪去胸腹部的皮毛，采用生理盐水心脏灌流，灌流完成后，迅速断头并用手术镊子剥离小鼠头骨，剥离出小鼠大脑，将完整的小鼠大脑分成左右两部分，其中一半大脑常规制备冰冻切片，用于形态学实验;另一半大脑用于分子生物学实验检测。
　　1.2.2 Western blot  取各组小鼠大脑海马组织，加入组织重量10倍的蛋白裂解液，超声裂解，之后放于冰上继续裂解1.5 h，低温下15 000 g离心20 min，取上清液，BCA法测定蛋白浓度，蛋白分装后置于-80℃保存。电泳过程：浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%，蛋白样品加样后，进行凝胶电泳，电泳条件为90 V，约15 min，之后调至120 V，直至溴酚蓝指示剂到凝胶底部。转膜过程：转印液为1×Transfer buffer，按顺序放入转印板阳极-海绵-滤纸两张-PVDF膜-分离胶-滤纸两张-海绵-转印板阴极，转印板置于电泳槽中，加入冰盒，120 V，转膜2 h。p-tau 202或CHAT抗体（1：3300）4°C孵育过夜，1×TBST冲洗5 min×3次，二抗室温下孵育1 h，1×TBST冲洗5 min×4次，ECL发光，Kodak-XAR 胶片曝光，将胶片进行扫描，用凝胶图像处理系统（Gel-Pro-Analyzer软件）分析目标条带的光密度值。 　　1.2.3免疫荧光染色和共聚焦激光扫描显微术  组织通过4%多聚甲醛固定，30%蔗糖沉糖，于冰冻切片机切片。制备出的冰冻切片于室温下自然晾干，在脑组织周围用组化笔画圈，dd H2O水化5 min，0.01 M PBS冲洗5 min×3次，血清封闭1 h，之后0.01 M PBS冲洗5 min×3次，一抗（1：100）4℃孵育过夜，荧光二抗分别孵育1 h，注意实验过程要避光，0.01 M PBS冲洗10 min×4次，滴加防荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下观察染色效果，并于40×镜下拍照（标尺长度50 μm）。
　　1.2.4 氧化应激指标检测  小鼠脑组织SOD活性及MDA含量测定方法严格按照试剂盒说明书操作。
　　1.3 统计学分析
　　采用SPSS11.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，每组实验平行重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 天麻素对tau转基因小鼠脑内tau蛋白磷酸化水平的影响
　　Tau蛋白异常磷酸化是AD主要的病理学改变之一。实验中，给予tau转基因小鼠天麻素治疗后，应用免疫荧光观察小鼠海马CA3区p-tau 202磷酸化水平。实验结果提示，与对照组小鼠比较，模型组小鼠（tau转基因小鼠）大脑海马CA3区p-tau 202的表达明显增加，整合光密度分析显示，其值分别为（0.053±0.010）和（0.116±0.009）;与模型组小鼠比较，天麻素治疗组小鼠（tau转基因小鼠+天麻素）脑内p-tau 202磷酸化水平减少，整合光密度值为（0.052±0.011）（P<0.05），见封三图7A。应用Western blot分别对三组小鼠大脑海马p-tau 202 表达水平进行分析。结果显示，模型组小鼠（tau转基因小鼠）脑内p-tau 202的表达水平显著高于对照组小鼠，而天麻素治疗组小鼠（tau转基因小鼠+天麻素）脑内tau蛋白在202位点的磷酸化水平较模型组小鼠有所降低，三组小鼠WB灰度值分析的数值分别为（100±0）、（406.0±15.1）和（174.0±18.0）（P<0.05），见封三图7B。
　　2.2天麻素对tau转基因小鼠脑内氧化应激相关指標的影响
　　通过对三组小鼠脑内MDA含量和SOD活性的检测考察天麻素对tau转基因小鼠脑内氧化应激的影响。同对照组小鼠相比较，模型组小鼠（tau转基因小鼠）脑内SOD活性下降，MDA含量明显升高;天麻素治疗后，治疗组小鼠（tau转基因小鼠+天麻素）脑内SOD活性升高，MDA含量有所降低，见表1。
　　2.3 天麻素对tau转基因小鼠脑内胆碱能神经元的保护作用
　　为了探讨天麻素是否能够对tau转基因小鼠脑内的胆碱能神经元起到保护作用，本研究采用分子生物学的实验方法考察了各组小鼠脑内CHAT的表达水平。Western blot结果显示，与模型组小鼠（tau转基因小鼠）相比，天麻素治疗组小鼠（tau转基因小鼠+天麻素）脑内CHAT的表达显著降低，WB灰度值分析显示，三组小鼠的数值分别为（100±0）、（344.0±15.9）和（167.0±33.5）（P<0.05），见图1。上述结果说明天麻素可以保护tau转基因小鼠脑内的胆碱能神经元。
　　注：Western blot方法考察各组小鼠脑内CHAT的表达变化。与野生对照组小鼠相比，*P<0.05;与模型组小鼠相比，#P<0.05
　　3 讨论
　　AD的神经病理学改变之一是神经细胞内出现tau蛋白异常磷酸化而引起的NFTs[6]。健康人的脑内，tau蛋白的主要作用是与神经元微管结合并可以调节微管的结构和功能，同时，通过与多种蛋白间相互作用行使如维持突触可塑性及轴浆运输等重要的生理作用[10-11]。然而，在AD患者脑内，tau蛋白发生异常磷酸化，这种过度的磷酸化可导致tau蛋白丧失上述生理功能，引发神经元轴突退化，最后聚集形成成对的螺旋丝，即所谓的神经元纤维缠结[12]。研究显示，在AD发病早期，患者脑内的tau蛋白磷酸化水平明显高于正常人水平[13]。上述的神经元病理改变会影响其突触发挥正常的生理功能，并最终导致学习及记忆功能的丧失[14-15]，因此，tau蛋白异常磷酸化在AD病变的过程中起着关键作用。
　　AD的发病机制尚不十分明确，目前认为，氧化应激是导致阿尔茨海默病等神经退行性疾病发生的重要原因之一，而且，在神经元损伤之前氧化应激就已经发生。其作用机制主要体现在氧自由基的产生增多和氧自由基清除障碍等两方面，在上述机制的作用下，脑组织极易受到氧自由基的攻击，进而诱发或加重疾病。文献显示，氧化应激产生的大量氧化自由基参与老年斑的产生及神经元纤维缠结的过程，这些自由基能够使一些生物大分子发生过氧化，引起神经元凋亡，最终引发学习记忆功能的丧失[16]。也有文献证实，Aβ老年斑介导自由基的攻击过程，同时氧化应激也能够促进老年斑的形成[17];此外，神经元纤维缠结中存在有大量的过氧化产物，tau蛋白被这种过氧化产物修饰后更易磷酸化，进而加重AD的发病。同时，作为氧化应激的标志性产物丙二醛（Malondialdehyde，MDA）也发生明显的变化。由此可见，氧化应激与AD的发病过程密切相关。
　　 天麻素是中药天麻块茎的主要成分之一，药理学研究提示，天麻素具有重要的抗氧化应激、抗炎和抗凋亡作用，还能够改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力。文献报道，天麻素可通过调控Nrf2/HO-1信号通路，下调炎症蛋白iNOS表达，进而减轻炎症反应，起到保护神经元的作用;此外，天麻素还可以通过激活p38 MAPK/Nrf2信号通路，诱导HO-1表达，减少氧化应激引起的SH-SYSY细胞死亡[18]。可见，天麻素通过其抗炎及抗氧化的作用，对中枢神经系统发挥保护作用。但是天麻素是否能够降低氧化应激反应以及是否能够降低tau蛋白磷酸化呢？为了探讨这一问题，本研究选用AD经典模型tau转基因小鼠，通过分子生物学和形态学的实验技术考察天麻素对tau蛋白磷酸化的影响;并对氧化应激相关指标进行检测。实验结果表明，天麻素能够降低AD模型小鼠脑内p-tau202的表达;此外，天麻素治疗组小鼠脑内MDA含量明显降低，SOD活性有所升高;治疗后的小鼠脑内CHAT的表达较AD模型小鼠降低。上述实验表明，天麻素可以通过减少氧化应激降低AD模型小鼠脑内tau蛋白的磷酸化水平，从而对神经元起到保护作用。但是，天麻素是通过哪一信号通路发挥作用的是我们需要继续研究的问题。 　　
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　　（收稿日期：2019-12-03）
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